一种珊瑚菜磷脂酶基因启动子及其应用

本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种珊瑚菜(glehnialittoralisfr.schmidtexmiq.)磷脂酶基因启动子及其应用。

背景技术：

启动子是功能基因5′端上游一段具有转录起始活性的dna序列，是基因表达与调控重要的顺式作用元件。根据启动子的转录模式，可将植物源的启动子分为三类：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子。组成型启动子，即基因的表达是持续性的，不受时空的限制或某种物质的诱导，如花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子camv35s、木薯叶脉花叶病毒启动子csvmv、玉米ubiqutin启动子等，通常用于获得目的基因超量表达的转基因植株。诱导型启动子是指基因的表达可以通过不同信号刺激来调控，如受光、温度、激素、病菌等因素诱导表达的启动子。组织特异性启动子，即启动子调控基因仅在植物某些特定的器官或组织部位表达，在其它部位和发育阶段不表达，具有发育调节的特性，如可以在根、茎、叶、花、种子中特异性表达的启动子。

在植物基因功能研究中，通常需要将有应用价值基因通过转基因技术导入植物体系中，进行功能验证。通过选择合适的启动子，控制基因的表达部位、表达量以及表达方式，对深入了解及验证基因功能有着重要的意义。由于组成型启动子是恒定表达的，目的基因可以在转基因植株的大多数部位表达，它的优点是强启动，可以超量表达基因，放大基因功能，缺点是外源基因超量表达可能会产生功能冗余，影响植物的生长发育。组织特异性启动子则可以弥补组成型启动子的不足，可以缩小目标基因的研究范围，控制表达模式，更有针对性进行科学研究。比如，应用根中特异性启动子启动目标基因仅在根部表达，可用于研究植物的渗透胁迫、营养吸收、根际分泌等问题；应用种子或果实特异性启动子，有助于提高转基因植物种子或果实的品质和产量，增加经济价值；应用花中的特异性启动子，可以进行植物受精、授粉、遗传发育等研究，特别是用来调控雄蕊、花药相关基因，也可利用基因工程手段创造雄性不育系。随着生物技术的进步，人工合成启动子在基因工程领域也备受关注，通过人工设计合成一段能够满足实践需求的启动子序列，能够精准调节基因的表达模式，对相关基因网络精细调控、组合优化，在代谢工程中应用广泛。

因此，挖掘、改造以及合成各种功能特异性的启动子，应用启动子在分子、细胞、植株水平精细调控基因的时空表达模式，具有科学的意义和广泛的前景。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种珊瑚菜磷脂酶基因启动子。本发明还要解决的另一技术问题在于提供前述珊瑚菜磷脂酶基因启动子的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种珊瑚菜磷脂酶基因启动子，其核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示。

所述的珊瑚菜磷脂酶基因启动子在基因工程中作为启动子的应用。

所述的应用是作为双向启动子的应用。

含有所述的珊瑚菜磷脂酶基因启动子的重组载体。

所述的含有珊瑚菜磷脂酶基因启动子的重组载体是重组植物表达载体。

所述的含有珊瑚菜磷脂酶基因启动子的重组载体中所述的珊瑚菜磷脂酶基因启动子和目的基因可操作的相连接。

所述的含有珊瑚菜磷脂酶基因启动子的重组载体在启动目的基因于植物叶片、根、茎、花序轴中特异表达的应用。

所述的含有珊瑚菜磷脂酶基因启动子的重组载体中所述的珊瑚菜磷脂酶基因启动子反向地和目的基因可操作的相连接。

所述的含有珊瑚菜磷脂酶基因启动子的重组载体在启动目的基因于植物雄蕊及柱头中特异表达的应用。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明首次提供了一种珊瑚菜磷脂酶基因的启动子序列，构建该启动子序列的重组表达载体进行转基因，可以驱动下游基因在拟南芥叶片、根、茎等部位表达；并且构建该启动子的反义序列重组表达载体进行植物转基因，能够实现下游基因在拟南芥雄蕊及柱头中特异高效表达，在其他组织中或发育阶段几乎不表达，说明其反义序列也具有启动子活性，特别在创制花粉败育、雄性不育植物材料时具有重要应用价值。

附图说明

图1为从珊瑚菜基因组中pcr扩增得到的磷脂酶基因启动子电泳图，m是标准分子量标记物(dnamarker)，箭头所指为启动子条带；

图2为构建启动子的反义序列与pcambia1301重组载体图；

图3为转化拟南芥后得到的转基因纯合阳性植株的gus染色图，a：拟南芥花朵；b：拟南芥叶片；c：果荚和花朵，gus报告基因在拟南芥花朵的雄蕊和柱头上表达；

图4为构建启动子的正义序列与pcambia1301重组载体图；

图5为转化拟南芥后得到的转基因纯合阳性植株的gus染色图，a：拟南芥8天叶片；b：拟南芥4天幼苗；c：茎和花朵，gus报告基因在拟南芥叶片、根、茎、花序轴处表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照试剂盒制造厂商所建议的方法。

实施例1：珊瑚菜磷脂酶基因启动子的获得

1.利用ctab法提取珊瑚菜基因组dna(珊瑚菜叶片于二零二零年五月采自江苏省中国科学院植物研究所种质资源圃)。

2.根据珊瑚菜磷脂酶序列设计并合成如下特异性引物：

sp1：5′-tctgttgcaccatgagacgtagcc-3′(seqidno.3)：

sp2：5′-ggaaaaccacctgtcacaaaccgc-3′(seqidno.4)；

sp3：5′-tcagcgaatccttccattgtcggg-3′(seqidno.5)。

珊瑚菜基因组dna为模版，与染色体步移试剂盒(genomewalking，takara，dalian)中的兼并引物ap3进行热不对称pcr反应，通过三次巢式pcr获得侧翼序列，并对pcr产物进行回收和dna测序。具体操作步骤和pcr扩增条件按照试剂盒中的说明书进行。

3.测序结果表明，在珊瑚菜基因组中得到磷脂酶基因atg上游2070bp的启动子区域(seqidno.1)，相应的其反义序列为seqidno.2。设计该启动子序列扩增引物prof：5′-ttcagcgaatccttccattgtcgg-3′(seqidno.6)；pror：5′-tttttctaccttctggctttgag-3′(seqidno.7)，以珊瑚菜基因组dna为模板，进行pcr扩增验证，验证结果如图1所示。

实施例2：构建含有上述启动子反义序列的pcambia1301植物重组表达载体

根据实施例1获得的珊瑚菜磷脂酶基因启动子反义序列和pcambia1301载体图谱，选择hindiii和bglii双酶切位点，以珊瑚菜基因组dna为模板，设计引物进行pcr扩增、双酶切、载体连接。将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，在50mg/l卡那抗生素的平板上37℃过夜培养，挑取阳性单菌落提质粒测序验证。获得的重组载体是以反义序列(seqidno.2)替换pcambia1301载体上的35s启动子，替换后β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)由上述反义序列启动表达，重组载体示意图如附图2所示。

实施例3：应用上述植物重组表达载体在拟南芥中表达外源蛋白

将实施例2中构建好的重组载体，转入农杆菌gv3101，蘸花法[clough，s.j.andbent，a.f.(1998)floraldip：asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantjournal，16，735-743]转化拟南芥，其所结种子在含有50mg/l的潮霉素的ms平板上生长一周，能够正常生长的植株则为转基因阳性植株，提取野生型及转基因植株基因组dna，进行进一步的pcr鉴定，将pcr鉴定为阳性的转基因植株的种子继续进行筛选，自交繁殖得到t3代纯合株系，应用纯合体株系进行β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，gus)染色观察。结果如附图3所示：gus报告基因在拟南芥花朵的雄蕊及柱头表达，而在花瓣、叶片、雌蕊等其他组织中几乎看不到gus染色。

实施例4：构建含有上述启动子正义序列(seqidno.1)的pcambia1301植物重组表达载体

根据实施例1获得的珊瑚菜磷脂酶基因启动子正义序列和pcambia1301载体图谱，选择hindiii和bglii双酶切位点，以珊瑚菜基因组dna为模板，设计引物进行pcr扩增、双酶切、载体连接。将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，在50mg/l卡那抗生素的平板上37℃过夜培养，挑取阳性单菌落提质粒测序验证。获得的重组载体是以正义序列(seqidno.1)替换pcambia1301载体上的35s启动子，替换后β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)由上述序列启动表达，重组载体示意图如附图4所示。

实施例5：应用实施例4中的植物重组表达载体在拟南芥中表达外源蛋白

将实施例4中构建好的重组载体，转入农杆菌gv3101，蘸花法[clough，s.j.andbent，a.f.(1998)floraldip：asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantjournal，16，735-743]转化拟南芥，其所结种子在含有50mg/l的潮霉素的ms平板上生长一周，能够正常生长的植株则为转基因阳性植株，提取野生型及转基因植株基因组dna，进行进一步的pcr鉴定，将pcr鉴定为阳性的转基因植株的种子继续进行筛选，自交繁殖得到t3代纯合株系，应用纯合体株系进行β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，gus)染色观察。结果如附图5所示：gus报告基因在拟南芥叶片叶柄、根、茎、花序轴表达较多。

序列表

<110>江苏省中国科学院植物研究所

<120>一种珊瑚菜磷脂酶基因启动子及其应用

<130>100

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2070

<212>dna

<213>glehnialittoralisfr.schmidtexmiq.

<400>1

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