棉花GhBASS5和拟南芥AtBASS5基因在植物抗旱性中的应用

棉花ghbass5和拟南芥atbass5基因在植物抗旱性中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种棉花ghbass5和拟南芥atbass5基因在植物抗旱性中的应用。


背景技术：

2.在植物面临的众多环境胁迫中，土壤水分供应的减少可能是最普遍但也最具有灾难性的胁迫之一。我国农业生产也正在面临着严重的水资源短缺与土壤荒漠化的问题，固着生长的高等植物不可避免地暴露在一些影响其生长发育的胁迫中，从而引起植物发生水势降低、细胞脱水、水流阻力等现象的产生，最终导致作物的产量降低甚至出现死亡。因此，培育抗旱作物新品种已成为缓解粮食安全问题的重要途径。
3.bass(bile acid:sodium symporter)称为na
+
依赖的胆汁酸转运体，bass5是bass家族中的一员，已有研究报道了atbass5的代谢功能，以及其在质体膜上转运二酮酸进入质体参与脂肪族芥子油苷的合成。在盐胁迫中，陆地棉ghbass5其在内皮层和木质部特异表达，参与植物对na
+
的吸收和长距离运输。这些研究结果为atbass5基因功能为bass5基因抗旱胁迫中的应用提供了理论基础。
4.随着基因工程技术发展，对植物抗逆基因进行分离及功能鉴定，然后运用转基因的方法改变植物本身的性状，使之更好地适应逆境环境，己经成为改良作物品质、提高作物产量的重要手段。耐旱品种的获得依赖于对作物抗旱机制的深入研究，因而研究基因在旱胁迫下的生理功能和耐逆机制，是获取抗旱新品种的重要途径，对未来农业的发展有着重要的意义，己成为全世界范围内的研究热点之一。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种棉花ghbass5和拟南芥atbass5基因在植物抗旱性中的应用。
6.解决上述技术问题所采用的技术方案是：棉花ghbass5基因在植物中抗旱性的应用。
7.本发明的植物为双子叶植物。
8.本发明的植物为棉花或拟南芥。
9.拟南芥atbass5基因在植物中抗旱性的应用。
10.本发明的的植物为双子叶植物。
11.本发明的植物为拟南芥。
12.本发明通过在拟南芥中异源表达ghbass5基因和在棉花中沉默棉花ghbass5基因、超表达ghbass5基因，证明了棉花ghbass5基因在抗旱性中的应用；本发明同时将拟南芥中atbass5基因进行突变，通过表型收集以及生理生化实验，验证了ghbass5基因同样具有抗旱性。本发明对提高植物的抗旱能力、作物抗旱育种及水肥管理优化提供理论指导具有重要的意义。
附图说明
13.图1为超表达ghbass5转基因对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析检测图。
14.图2为wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥在土壤干旱胁迫前后的生长情况。
15.图3为在10％与25％(w/v)peg在水培环境下模拟干旱胁迫wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥的生长情况。
16.图4为在10％peg模拟干旱胁迫下wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥的相对含水量(rwc)情况。
17.图5为在10％peg模拟干旱胁迫下下wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥的水分亏缺率(wsd)情况。
18.图6为在10％peg模拟干旱胁迫下wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥的可溶性糖情况。
19.图7为在10％peg模拟干旱胁迫下wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥的脯氨酸情况。
20.图8为在正常生长条件、10％与25％(w/v)peg在水培环境下、10％与25％环境下模拟干旱胁迫wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥体的气孔表型变化。
21.图9为在正常生长条件、10％与25％(w/v)peg在水培环境下、10％与25％环境下模拟干旱胁迫wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥体的气孔宽长比变化。
22.图10为在10％与25％(w/v)peg在水培环境下模拟干旱胁迫wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥体内芥子油苷的总含量的变化。
23.图11为在10％与25％(w/v)peg在水培环境下模拟干旱胁迫wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥体内脂肪族芥子油苷总量的变化。
24.图12为在10％与25％(w/v)peg在水培环境下模拟干旱胁迫wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥体内10种芥子油苷含量的变化。
25.图13为实时荧光定量pcr验证ghbass5基因表达量。
26.图14为10％peg模拟干旱胁迫前后棉花表型。
27.图15为10％peg模拟干旱胁迫前后棉花叶片气孔表型。
28.图16为10％peg模拟干旱胁迫前后棉花叶片气孔宽长比。
具体实施方式
29.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
30.实施例1
31.超表达ghbass5转基因拟南芥的制备方法如下：
32.(1)棉花ghbass5基因的扩增
33.根据公开专利名称为棉花转运蛋白ghbass5基因在植物耐盐中的应用，专利申请号为201711167203.x，中记载制备的t载体中使用下列引物扩增ghbass5，如表1、2所示，
34.表1 pcr反应体系位为：
[0035][0036]
表2 pcr反应程序为：
[0037][0038][0039]
如图1所示，对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析检测，并将目的片段回收与纯化，胶回收过程参照gel dna extractionmini kit(诺唯赞，南京，中国)使用说明进行操作。
[0040]
(2)pcambia1300
‑
ghbass5
‑
egfp载体的构建
[0041]
(2.1)将pcr产物胶回收使用kpni和xbai两种限制性内切酶同时酶切载体pcambia1300
‑
egfp，使用gel dna extractionmini kit(诺唯赞，南京，中国)回收目的基因与载体片段，反应体系如表3所示。
[0042]
表3酶切反应体系：
[0043][0044]
反应条件为37℃3h；
[0045]
(2.2)检测纯化产物浓度，连接载体与目的基因，连接体系为t4 dna连接酶buffer 1μl、t4 dna连接酶1μl、纯化后的载体片段1μl、目的片段7μl，16℃连接过夜；
[0046]
(2.3)转化大肠杆菌dh5α：将dh5α感受态细胞从
‑
80℃拿出，插入冰中，加入连接产
物，轻轻拨打管底混匀，冰浴30min，42℃水浴60s，迅速放回冰中，冰浴2min，向离心管中加700μl无抗生素的lb液体培养基，37℃，180rpm摇床培养1h后，吸取200μl培养液涂到含相应抗性的lb固体培养基上，将平板放到37℃培养箱中，正置培养半小时后，倒置培养14h；
[0047]
(3)pcambia1300
‑
ghbass5
‑
egfp质粒的提取：采用试剂盒fastpure plasmid mini kit诺唯赞，南京，中国)取质粒,操作方法参照使用说明书。
[0048]
(4)侵染拟南芥：将测序正确的ghbass5超表达质粒载体转化农杆菌gv3101，转化方法同eha105转化方法；
[0049]
(4.1)挑选pcr验证正确的农杆菌摇菌，扩大培养后离心收集菌体，制备渗透培养基溶液，渗透培养基溶液为含200mg/l的as、5％的蔗糖和0.02％的silwet l
‑
77的1/4ms，加适量渗透培养基溶液至od
600
为0.8～1.0；
[0050]
(4.2)把含有农杆菌的渗透培养基溶液转倒入烧杯中，倒置拟南芥植株，使花序浸入到溶液中，然后轻轻摇晃15s；
[0051]
(4.3)取出侵染处理过的拟南芥植株，沥水3～5s向植株稍微喷点水，罩上保鲜膜，于避光条件下侧放1d以增加农杆菌侵染转化率，1d后取下保鲜膜，使培养盆直立放置，光照培养，光照时间为16h/d左右，一周后，再重复侵染一次；
[0052]
(5)筛选转基因植株：收获种子后，将种子表面消毒，将种子种到含25mg/l的潮霉素的1/2ms固体培养基上，放入4℃冰箱2
‑
3d后取出放光照培养室培养10天后，能够长出两片真叶的为t1代转基因植株。筛选出在含潮霉素的1/2ms固体培养基上能全部存活的t3代纯合转基因植株，使用t4代纯合株系；
[0053]
(6)验证转基因植株：使用高效植物plant dna isolghion mini kit提取试剂盒(诺唯赞，南京，中国)提取转基因拟南芥和dna，使用ghbass5的cds全长克隆引物进行pcr，检测ghbass5是否导入到拟南芥基因组中。
[0054]
t
‑
dna插入atbass5突变体拟南芥(atbass5)的制备方法：
[0055]
atbass5敲除突变体salk_126525，将t
‑
dna插入atbass5的5'utr中，购自nasc。
[0056]
实验一、利用野生型拟南芥(wide type，wt)、超表达棉花ghbass5转基因拟南芥(over expression，oe)、dna插入atbass5突变体拟南芥(atbass5)进行以下实验验证ghbass5基因在拟南芥抗旱性中的应用、atbass5基因在拟南芥抗旱性中的应用。
[0057]
(1)胁迫前后植株表型变化情况
[0058]
如图2所示，wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥在土壤正常生长4周后停止浇水10天，使其自然干旱，在正常的生长状态下三种基因型的生长状态相似、无明显差异。当干旱胁迫降临时，与wt植株相比，oe植株长势良好、叶片繁茂，而atbass5植株表现出植株生长减缓、叶片稀疏。如图3所示，wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥在10％与25％(w/v)peg在水培环境下模拟干旱胁迫，10％peg胁迫下wt略有萎蔫状态，oe植株叶片平整，atbass5植株发生萎蔫；25％peg胁迫处理下wt与atbass5发生萎蔫，oe植株仍旧保持着叶片平整、色彩鲜艳，上述实验与土壤干旱结果一致。综上所述，超表达ghbass5基因能够提高植物的抗旱能力，而atbass5基因突变后植物的抗旱能力显著减弱。
[0059]
(2)胁迫前后相对含水量与水分亏缺率的变化情况
[0060]
如图4、5对wt、oe和atbass5三种基因型拟南芥相对含水量(rwc)与水分亏缺率(wsd)进行测量发现，干旱处理条件下，三种bass5基因型拟南芥的rwc都有所减少，wt植株
由76.62％降低至50.35％、oe植株由75.32％降低至71.87％、oe由75.17％降低至46.83％；wt、oe、atbass5三种拟南芥的wsd都有所增加，wt植株由23.38％增加至49.65％、oe植株由24.68％增加至28.13％、atbass5植株由24.83％增加至53.17％。总结上述结果发现，超表达ghbass5基因能够提高植物的抗旱能力，而atbass5基因突变后植物的抗旱能力显著减弱。
[0061]
(3)干旱胁迫后叶片可溶性糖与脯氨酸含量的变化
[0062]
可溶性糖、脯氨酸作为植物体内的重要的渗透调节物质，在干旱胁迫条件下，植物可以通过增加上述两者的含量来提高植物体内的渗透势从而提高的抗旱能力，因此测量和分析可溶性糖和脯氨酸含量对解析植物的抗旱性具有重要理论意义。本实验使用10％(w/v)peg模拟干旱胁迫条件下，对三种bass5基因型拟南芥(wt、oe、atbass5)叶片中可溶性糖和脯氨酸含量进行测量。如图6、7所示，在未进行干旱处理条件测得三种基因型拟南芥的可溶性糖、脯氨酸含量没有显著差异，而在10％(w/v)peg模拟干旱胁迫后，表现出过表达ghbass5拟南芥中可溶性糖和脯氨酸含量高于野生型拟南芥；atbass5突变体拟南芥中可溶性糖和脯氨酸含量低于野生型拟南芥。因此干旱胁迫条件下超表达ghbass5基因拟南芥通过增加两种渗透调节物质的含量提高了拟南芥抗旱能力，证明超表达ghbass5提高植物干旱胁迫，突变atbass5后植物抗旱能力减弱。
[0063]
(4)干旱胁迫前后植物叶片气孔的变化
[0064]
气孔开闭在维持植物水平衡中起着非常重要的作用，干旱条件下，植物通过关闭气孔减小水分的蒸腾从而抵抗干旱胁迫。如图8、9所示，正常情况下oe植株叶片气孔的开度小于wt与atbass5在植物叶片气孔的开度，且wt与atbass5植株差异不显著，经过peg处理后，wt和oe植株气孔开度逐渐减小，并且oe植株的叶片气孔开度明显小于wt植株的叶片气孔开度，而atbass5植株在此胁迫处理条件下气孔未发生闭合。再次说明，超表达ghbass5基因能够提高植物的抗旱能力，而atbass5基因突变后植物的抗旱能力显著减弱。
[0065]
(5)干旱胁迫前后芥子油苷含量的变化
[0066]
芥子油苷在调节植物干旱胁迫具有重要作用，因此本实验对三种基因型拟南芥进行芥子油苷含量的测量。
[0067]
图10所示，本实验测定出10种gls，包括6种脂肪族芥子油苷(ibe、pro、sin、4msob、nap、8msoo)和4种吲哚族芥子油苷(eru、gbc、4me、neo)。经过干旱胁迫以后，三种基因型拟南芥的gls的含量都发生了增加，其中wt植株胁迫前后分别为的4.72μmol/gdw、17.06μmol/gdw；oe植株胁迫前后分别为7.03μmol/gdw、18.38μmol/gdw，atbass5植株胁迫前后分别3.19μmol/gdw、4.92μmol/gdw。上述结果表明，ghbass5基因参与gls的合成，并且超表达ghbass5增强了干旱胁迫下植物gls的合成能力。
[0068]
图11所示，在正常生长条件下，三种ghbass5基因型拟南芥中吲哚族芥子油苷差异并不显著，干旱处理后三种基因型拟南芥叶片中的吲哚族芥子油苷含量都明显曾高，其中ghbass5植株中吲哚芥子油苷含量最高，其次是保持在相同的水平的wt与oe植株。
[0069]
图12所示，正常条件下过，oe植株中脂肪族芥子油苷含量显著高于wt与atbass5植株；在干旱条件下，wt与oe植株中脂肪族芥子油苷含量显著增加，且oe植株中的脂肪族芥子油含量仍旧显著高于wt植株，但atbass5植株中脂肪族芥子油苷含量并在胁迫前后没有发现显著变化。
[0070]
综上所述，超表达ghbass5基因能够提高植物的抗旱能力，而atbass5基因突变后植物的抗旱能力显著减弱。综上所述，ghbass5、atbass5基因在应对植物抗旱方面具有重要作用。
[0071]
实施例2
[0072]
根据公开专利名称为棉花转运蛋白ghbass5基因在植物耐盐中的应用，专利申请号为201711167203.x，中记载获得阴性对照vigs
‑
gfp、ghbass5基因沉默棉花vigs
‑
ghbass5，vox
‑
ghbass5获得方法发明人对ghbass5基因耐旱应答调节等方面进行了进一步研究。
[0073]
vox
‑
ghbass5的制备方法如下：
[0074]
病毒介导超表达(vox：virus
‑
mediated overexpression)vox系统，具体包括：pcabs
‑
α，pcabs
‑
β，pcabs
‑
γ1和pcabs
‑
γ2构成的四组分bsmv载体。
[0075]
(1)按照现有技术扩增ghbass5特异片段后构建融合载体pcabs
‑
γ2:ghbass5:gfp，转化农杆菌菌落，筛选获得相应的阳性农杆菌菌落；将上述含有重组载体的阳性农杆菌菌落分别到yeb培养基(kan:100mg/ml,gen:30mg/ml,rif:20mg/ml)中，28℃、180rpm培养至od
600
为1.5左右；然后将菌液6000rpm离心6min收集菌体细胞，并以适当体积的重悬液(200μmol/l as，10mmol/lmgcl2，10mmol/l mes 1m)重悬菌体，至终浓度为1.5(od600)，将重悬液于室温下静置3h待用；
[0076]
(2)摇菌：在超净工作台中，挑取验证好的阳性克隆pcabs
‑
α，pcabs
‑
β，pcabs
‑
γ1，pcabs
‑
γ2，以及其他内源性基因与ghbass5融合的载体如pcabs
‑
γ2:ghbass5:gfp，菌落等分别接种到含有kan、gen、rif三种抗生素的yeb液体培养基中，28℃摇床上转速设置为200rpm，避光培养24h左右。
[0077]
(3)扩大培养：在无菌操作台内，将上述小摇的一系列组分以1:100(即1ml菌液混合于100ml的液体yeb中)的比例重新接入50ml含有kan、gen、rif三种抗生素yeb液体培养基中，28℃，200rpm的摇床，避光培养12h左右，至菌液od600为1.5左右。
[0078]
(4)菌液重悬，固定od值：将培养好的菌液转移至无菌的50ml离心管内，并在室温条件下6,000rpm离心8min，弃上清，富集菌体细胞，以适当体积的重悬液(200μmol/l as，10mmol/l mgcl2，10mmol/l mes)重悬富集的菌体，用分光光度计测定浓度并补加重悬液稀释至终浓度为0.8(od600)，分别将pcabs
‑
α，pcabs
‑
β，pcabs
‑
γ1，pcabs
‑
γ2(pcabs
‑
γ2:ghbass5)及其他融合载体的重悬液按体积比1:1:1:1混匀，将混匀后的重悬液在室温下避光静置3
‑
5h，用于注射棉花叶片。
[0079]
(5)接种转化：准备1ml的注射器，用注射器针头在棉花子叶背面扎孔但不扎穿，每片子叶4个孔，然后用去掉针头的注射器吸取菌液，在背面有孔的位置注射菌液，使菌液完全进入叶片，两片子叶都进行注射；待注射完毕后，将棉花进行避光培养过夜，第二天转到光照16h黑暗8h条件下培养。
[0080]
(6)培养10d后，取注射含pcabs
‑
γ2:ghbass5的棉花植株的幼嫩真叶，提取rna，经反转录获得cdna，进行实时荧光定量pcr检测ghbass5基因的表达量。
[0081]
实时荧光定量pcr检测引物设计如下：
[0082]
q
‑
ghbass5 f:acccaggtcaggaatttgaaccggaa
[0083]
q
‑
ghbass5 r:aaaacccaatgcaggggcatagtacct
[0084]
q
‑
ubq7f:ctcctttgttgctgttgactac
[0085]
q
‑
ubq7r:gcacaatgttaccgtacagatc
[0086]
反转录过程：
[0087]
反转录实验按照
ⅲꢀ
rt supermix for qpcr(诺唯赞，南京，中国)。使用depc处理的200μl离心管中配制如表4所示：
[0088]
表4dna消化体系
[0089][0090]
上述溶液用移液器轻柔吹打均匀，反应条件为42℃2min；
[0091]
将上述溶液加入4μl 5
×
hiscript
ꢀⅲꢀ
qrt supermix，吹打均匀后37℃15min，85℃5s；
[0092]
上述产物可用于后续qpcr反应或
‑
20℃保存。
[0093]
实时荧光定量pcr过程如表5
‑
6所示，荧光定量pcr实验按照chamq universal sybr qpcr master mix(诺唯赞，南京，中国)。
[0094]
表5实时荧光定量pcr反应体系
[0095][0096]
短暂离心后，按照下列条件进行反应。
[0097]
表6实时荧光定量pcr反应程序
[0098][0099]
如图13，经实时荧光定量沉默vigs
‑
ghbass5棉花中ghbass5基因表达量下降，超表
达vox
‑
ghbass5棉花中ghbass5基因表达量上升。
[0100]
实验二：利用野生型棉花(wide type，wt)、沉默ghbass5基因棉花(vigs
‑
ghbass5)、超表达ghbass5转基因棉花(vox
‑
ghbass5)、对照棉花(vigs
‑
gfp)进行以下实验验证ghbass5在棉花中抗旱性的应用。
[0101]
(1)胁迫前后植株表型变化情况
[0102]
如图14所示，wt、vigs
‑
gfp、vigs
‑
ghbass5和vox
‑
ghbass5三种棉花在水培营养液中正常生长4周后，在培养液中加入peg(终浓度10％)模拟干旱，在正常的生长状态下三种基因型棉花的生长状态相似、无明显差异。当干旱胁迫降临时，与wt与vigs
‑
gfp植株相比，vigs
‑
ghbass5植株表现出植叶片萎蔫抗旱能力减弱，vox
‑
ghbass5表型出叶片挺立抗旱能力较强。
[0103]
(2)胁迫前后植株气孔变化情况
[0104]
如图15、16所示，对正常生长状态下的wt、vigs
‑
gfp、vigs
‑
ghbass5和vox
‑
ghbass5四种棉花叶片的气孔进行观察测量统计，四种基因型棉花气孔宽长比保持相同的水平。经过peg处理后，宽长比大学从小至大依次为vox
‑
ghbass5、wt、vogs
‑
gfp、vigs
‑
ghbass5。从上述实验可以看出vigs
‑
ghbass5植株在此胁迫处理条件下气孔未发生闭合，宽长比维持在胁迫处理前水平；vox
‑
ghbass5关闭能力更强。
[0105]
综上所述，沉默ghbass5导致植物响应干旱胁迫的气孔调节功能丧失，进而降低棉花对干旱的敏感性，减低棉花的抗旱性。
[0106]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。