etv4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用
技术领域
1.本发明涉及etv4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：2.增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblasts，简称hsf)在创面愈合过程中被过度激活，产生大量的细胞外基质，使其在细胞外过度沉积，是导致增生性瘢痕形成的重要原因。在增生期瘢痕中，成纤维细胞合成和分泌胶原能力增强，特别是ⅰ、ⅲ型胶原的含量远远高于正常皮肤。应用细胞生物学技术使瘢痕肌成纤维细胞逆转为成纤维细胞或转化为其它细胞，减少ⅰ、ⅲ型胶原产生，重塑细胞外基质，为瘢痕的治疗开辟了新方向。如何调控瘢痕成纤维细胞表型改变是目前瘢痕治疗的研究热点。
3.etv4(英文全称为ets translocation variant 4)基因，属于ets(e26 translocation
‑
specific)转录因子家族，又叫做pea3或e1af。目前，etv4基因相关的研究主要集中在其与肿瘤局部侵袭和远处转移之间的关系，例如：在一种低转移性的乳腺癌细胞mcf7中过表达etv4，则会导致其侵袭性增加；而在肿瘤细胞中敲低etv4的表达，则会导致肿瘤侵袭性降低。但是，etv4基因与增生性瘢痕成纤维细胞之间的关联性，目前并没有相关报道。
技术实现要素：4.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供etv4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用。
5.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：etv4基因在重编程增生性瘢痕成纤维细胞中的应用。
6.本发明的原理是：
7.本发明分别检测增生性瘢痕成纤维细胞及正常真皮成纤维细胞中mrna表达水平，发现增生性瘢痕成纤维细胞中etv4表达明显低于正常真皮成纤维细胞。通过构建etv4过表达慢病毒载体，转染人增生性瘢痕成纤维细胞，使其ⅰ、ⅲ型胶原表达明显下调，在体外实现改善瘢痕的作用。因此，etv4基因可以用于重编程增生性瘢痕成纤维细胞，既开拓了etv4基因新的应用领域，也开拓了新的重编程增生性瘢痕成纤维细胞的基因，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。
8.本发明的有益效果是：
9.本发明经过研究发现，etv4基因可以用于重编程增生性瘢痕成纤维细胞，既开拓了etv4基因新的应用领域，也开拓了新的重编程增生性瘢痕成纤维细胞的基因，具有积极的药学价值和广泛的社会意义。
10.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
11.进一步，所述重编程增生性瘢痕成纤维细胞的方法是：
12.步骤1：取新鲜的人增生性瘢痕标本，进行组织消化，分离获取增生性瘢痕成纤维细胞；
13.步骤2：将如seq id no.1所示的人etv4基因cds区编码序列连接至pcdh质粒载体上，获取pcdh
‑
etv4过表达质粒并进行扩增；
14.步骤3：将目的基因etv4质粒、包装质粒pspax2和包膜质粒pmd2.g共转染hek 293t细胞，收集病毒上清，浓缩后，获得慢病毒悬液；
15.步骤4：取步骤1的增生性瘢痕成纤维细胞，培养传至第3代，得到p3代增生性瘢痕成纤维细胞，待细胞融合至70％
‑
80％，用步骤3的慢病毒悬液进行感染，72h后，即得到经过etv4基因重编程的增生性瘢痕成纤维细胞。
16.采用上述进一步的有益效果是：通过上述操作，可以获得过表达etv4基因的增生性瘢痕成纤维细胞。
17.更进一步，步骤1中，所述组织消化的具体方法是：取新鲜的人增生性瘢痕标本，用无菌pbs清洗后剪成细条状，放入质量百分数为0.25％的中性蛋白酶溶液中，置于37℃孵育2h后分离表皮与真皮；取真皮组织剪碎呈泥状，加入到10倍体积的质量百分数为0.2％的i型胶原酶溶液中，置于37℃摇床中，采用转速为80rpm
‑
100rpm，孵育2h，即得。
18.采用上述进一步的有益效果是：通过上述步骤，可以将增生性瘢痕组织进行消化，以便进一步分离出其中的瘢痕成纤维细胞。
19.更进一步，步骤1中，所述分离是采用70μm滤网过滤后，300g离心5min，加入5ml含10％胎牛血清的dmem低糖培养基重悬，接种于细胞培养皿内，在37℃，5％co2培养箱中培养。
20.采用上述进一步的有益效果是：通过上述方式，可以获得活性良好的原代增生性瘢痕成纤维细胞，更有利于进一步实验的开展。
附图说明
21.图1为倒置显微镜下，增生性瘢痕成纤维细胞原代hsf培养48h的形态。
22.图2为倒置显微镜下，增生性瘢痕成纤维细胞3代hsf培养48h的形态。
23.图3为etv4插入质粒载体pcdh
‑
cmv
‑
mcs
‑
ef1
‑
puro的位置；
24.图4为过表达质粒etv4
‑
pcdh琼脂糖电泳图谱，xbai和nhei酶切图谱；其中，通道1为质粒dna；通道2为用ndei/nhei酶切；通道m为dna标记；
25.图5为倒置荧光显微镜下，观察pcdh
‑
etv4载体转染hek 293t细胞的照片；
26.图6为倒置荧光显微镜下，观察pcdh
‑
etv4病毒感染hsf细胞的照片；
27.图7为倒置显微镜下，观察pcdh病毒感染hsf细胞的照片；
28.图8为倒置显微镜下，观察pcdh
‑
etv4病毒感染hsf细胞的照片；
29.图9为慢病毒感染后hsf的etv4基因表达水平
30.图10为过表达etv4的hsf纤维化相关基因mrna表达水平；
31.图11为过表达etv4的hsf纤维化相关基因蛋白表达水平。
具体实施方式
32.以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发
明，并非用于限定本发明的范围。
33.实施例1：质粒构建和细胞培养
34.1.1增生性瘢痕成纤维细胞的分离培养
35.取新鲜的人增生性瘢痕标本，所有增生性瘢痕的获取均得到整形外科医院伦理委员会的批准，并取得患者及家属的知情同意。用无菌pbs清洗2次后剪成细条状，放入质量百分数为的0.25％中性蛋白酶溶液中，置于37℃孵育2h后分离表皮与真皮，取真皮组织剪碎呈泥状。将剪碎的真皮组织加入到10倍体积的质量百分数为0.2％的i型胶原酶溶液，置于37℃摇床中孵育2h，转速为80rpm
‑
100rpm。待瘢痕组织消化完全后(观察无块状组织即可)，用70μm滤网过滤，300g离心5min，加入5ml含10％胎牛血清的dmem低糖培养基重悬，接种于细胞培养皿内，在37℃，5％co2培养箱中培养。倒置显微镜下观察可见：酶解法消化培养的增生性瘢痕成纤维细胞，原代培养48h后的细胞形态相对较小，大部分呈短梭形(见图1)。细胞平均传代时间约为2
‑
3天，培养至第3代细胞体积相对较大，形态不一，部分细胞呈不规则三角形或多角形(见图2)。
36.1.2构建etv4过表达质粒
37.检索ncbi数据库，获得人etv4基因cds(coding sequence)区编码序列，如seq id no.1所示。
38.atggagcggaggatgaaagccggatacttggaccagcaagtgccctacaccttcagcagcaaatcgcccggaaatgggagcttgcgcgaagcgctgatcggcccgctggggaagctcatggacccgggctccctgccgcccctcgactctgaagatctcttccaggatctaagtcacttccaggagacgtggctcgctgaagctcaggtaccagacagtgatgagcagtttgttcctgatttccattcagaaaacctagctttccacagccccaccaccaggatcaagaaggagccccagagtccccgcacagacccggccctgtcctgcagcaggaagccgccactcccctaccaccatggcgagcagtgcctttactccagtgcctatgacccccccagacaaatcgccatcaagtcccctgcccctggtgcccttggacagtcgcccctacagccctttccccgggcagagcaacggaatttcctgagatcctctggcacctcccagccccaccctggccatgggtacctcggggaacatagctccgtcttccagcagcccctggacatttgccactccttcacatctcagggagggggccgggaacccctcccagccccctaccaacaccagctgtcggagccctgcccaccctatccccagcagagctttaagcaagaataccatgatcccctgtatgaacaggcgggccagccagccgtggaccagggtggggtcaatgggcacaggtacccaggggcgggggtggtgatcaaacaggaacagacggacttcgcctacgactcagatgtcaccgggtgcgcatcaatgtacctccacacagagggcttctctgggccctctccaggtgacggggccatgggctatggctatgagaaacctctgcgaccattcccagatgatgtctgcgttgtccctgagaaatttgaaggagacatcaagcaggaaggggtcggtgcatttcgagaggggccgccctaccagcgccggggtgccctgcagctgtggcaatttctggtggccttgctggatgacccaacaaatgcccatttcattgcctggacgggccggggaatggagttcaagctcattgagcctgaggaggtcgccaggctctggggcatccagaagaaccggccagccatgaattacgacaagctgagccgctcgctccgatactattatgagaaaggcatcatgcagaaggtggctggtgagcgttacgtgtacaagtttgtgtgtgagcccgaggccctcttctctttggccttcccggacaatcagcgtccagctctcaaggctgagtttgaccggcctgtcagtgaggaggacacagtccctttgtcccacttggatgagagccccgcctacctcccagagctggctggccccgcccagccatttggccccaagggtggctactcttactag(seq id no.1)。
39.将此序列连接至pcdh质粒载体上：先利用限制性内切酶xbai和nhei将载体pcdh
‑
cmv
‑
mcs
‑
ef1
‑
puro切断，然后将擎科公司合成的带有xbai和nhei限制性内切酶序列的etv4蛋白编码序列，在dna连接酶的作用下与pcdh
‑
cmv
‑
mcs
‑
ef1
‑
puro载体重新连接(见图3)，擎
科公司将构建的质粒转化并提供培养好的pcdh
‑
etv4菌株。
40.质粒检验：将构建的质粒转化并获取培养好的pcdh
‑
etv4菌株，通过质粒提取，获得少量质粒，经限制性内切酶xbai和nhei酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳进行检验(见图4)。
41.实施例2：病毒侵染细胞
42.2.1慢病毒包装
43.目的基因etv4质粒、包装质粒pspax2和包膜质粒pmd2.g通过jetprime转染试剂缓冲液共转染hek 293t细胞(见图5)，获得高滴度的病毒。
44.2.2慢病毒感染
45.用含pcdh
‑
etv4过表达质粒的病毒和pcdh空载体质粒的病毒分别感染瘢痕成纤维细胞：取增生性瘢痕成纤维细胞的p3代细胞，制成单细胞悬液，调整密度为1
×
105/ml接种于6孔板上。待细胞长至70
‑
80％，取感染复数(moi)值为350。向细胞中加入重组慢病毒载体(1.26
×
10
10
pfu/ml)。加入病毒体积计算方式为：moi＝病毒量(ml)
×
病毒滴度(pfu/ml)
÷
细胞数(个)。轻轻晃动6孔板使病毒液与细胞充分接触，24h更换新鲜培养基继续培养。病毒感染细胞24h、48h和72h后在倒置荧光显微镜下观察细胞的荧光表达(见图6)。
46.实施例3：增生性瘢痕成纤维细胞纤维化相关基因表达
47.对照组为感染pcdh空载体质粒的hsf(见图7)，实验组为感染pcdh
‑
etv4过表达质粒的hsf(见图8)。etv4在过表达组中的基因表达量显著升高(见图9)；过表达etv4后，纤维化相关基因col1a1、col3a1及acta2的mrna及蛋白水平表达显著下调，mmp1的表达出现显著上调(见图10和图11)。
48.具体实施过程如下：
49.3.1 rt
‑
pcr检测慢病毒感染后细胞内etv4的基因表达
50.(1)向上述实验组及对照组增生性hsf中分别加入pbs溶液冲洗2
‑
3次，吸尽液体后加入1ml trizol，在室温下放置5min，待其充分裂解，然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落。
51.(2)将细胞裂解液转移至1.5ml离心管中，并加入0.2ml三氯甲烷，盖紧ep管盖后，用手上下颠倒震荡(勿涡旋剧烈震荡)混匀15s，得到粉红色浑浊液体，无分层现象，后室温静置15min。
52.(3)12000g，4℃，离心15min后液体分三层，其中上层为无色水相，主要包含细胞rna。
53.(4)小心吸取上层无色水相液体并转移至新的无rna酶ep管，避免吸到中间的白色层及下层粉红色有机相。
54.(5)向上述得到的无色溶液中加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min。
55.(6)4℃，12000g，离心10min后弃上清，缓慢沿着ep管壁中加入1ml75％的乙醇，轻轻混匀。
56.(7)12000g，4℃，离心5min，小心吸尽上清，勿触碰ep管底部白色沉淀，室温干燥后，加入30μl
‑
50μl的rnase free水溶解rna。
57.(8)使用nanodrop微量分光光度计测定rna浓度、od
260nm
和od
280nm
的值，以od
260nm
/od
280nm
在1.8
‑
2.0视为达标，上机检测细胞总rna浓度。测定rna浓度后将rna逆转录成cdna。以gapdh为内参，设计一对特异性引物(表1)，引物合成由上海擎科生物工程公司完成。
58.表1基因及引物序列
[0059][0060]
pcr扩增特异序列具体操作如下：
[0061]
(1)引物稀释：将装有上、下游引物的ep管以4000rpm离心4
‑
5min，缓慢打开管盖，加入depc水稀释至10μm，盖上盖后充分震荡混匀备用。
[0062]
(2)以cdna为模板作pcr，每组3个复孔，构建20μl总反应体系。
[0063]
(3)20μl反应体系：cdna 1μg,forward primer 0.6μl，reverse primer 0.6μl，2
×
syber green master mix 10μl,ddh2o补至20μl。
[0064]
(4)反应条件：95℃，10min；94℃，15s，60℃，30s，72℃，45s，40个循环。
[0065]
3.2 rt
‑
pcr检测两组细胞col1a1、col3a1及acta2等纤维化相关基因的表达差异。具体实验步骤同上述3.1。
[0066]
3.3 western blot检测两组细胞col1a1、col3a1及acta2等纤维化相关基因的表达差异
[0067]
(1)蛋白提取
[0068]
①
将在6孔板中培养的增生性瘢痕成纤维细胞弃掉培养基，用预冷的pbs洗涤2次。
[0069]
②
倒掉pbs后，加入100μl ripa裂解液(含1mm的pmsf和蛋白酶抑制剂，现用现配)。
[0070]
③
轻轻吹打细胞，使裂解液和细胞充分接触3
‑
5min，然后全部转移至1.5ml离心管
中，冰浴30min，每隔5min轻柔震荡一次。
[0071]
④
冰浴结束后4℃，12000rpm，离心10min，收集上清。
[0072]
(2)bca蛋白定量
[0073]
①
将浓度为25mg/ml的碧云天蛋白贮存液用pbs稀释至0.5mg/ml的蛋白标准品。
[0074]
②
根据样品数量，在50体积bca试剂a中加入1体积bca试剂b，配制适量的bca工作液，并充分混匀。
[0075]
③
在96孔板的标准品孔中依次加入0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl和20μl标准品，每孔加pbs补足到20μl，相当于96孔板中混合的溶液浓度分别为0mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml和0.5mg/ml。
[0076]
④
另取4μl上述提取蛋白上清到96孔板中，用pbs补足至20μl。
[0077]
⑤
在每个样本蛋白及标准品蛋白孔中加入200μl bca工作液，并在37℃孵育20min。
[0078]
⑥
测定562nm的吸光度。
[0079]
⑦
根据标准品吸光度绘制标准曲线，并根据标准曲线公式及使用的样品体积计算出样品蛋白上清浓度。
[0080]
(3)sds
‑
page聚丙烯酰胺蛋白电泳胶的配制：
[0081]
①
选取1.5mm厚的玻璃胶板，10齿梳子，作为制胶模型。
[0082]
②
配制10％分离胶后立即混匀，取7.5ml倒入固定好的胶板中，并在分离胶上方轻轻加入3ml去离子水，压平分离胶胶面。
[0083]
③
室温静置30min，待分离胶凝固后，倒掉去离子水，并用滤纸吸干残余水分。
[0084]
④
配制浓缩胶后混匀，倒入分离胶上层胶板中，插入10齿电泳梳。
[0085]
⑤
室温静置20min，待浓缩胶凝固后拔掉电泳梳。
[0086]
(4)蛋白电泳：
[0087]
①
取上述等量的(20
‑
40μg)提取蛋白，用去离子水调至总体积一致。
[0088]
②
加入5xsds loading buffer，100℃煮沸5min，室温冷却。
[0089]
③
蛋白电泳槽中倒入电泳液，没过胶板。
[0090]
④
蛋白上样。
[0091]
⑤
上样结束后，接通电源，先用80v恒压至样品进入分离胶，后上调电压至120v，当前端指示剂完全进入电泳缓冲液，关掉电源，电泳结束。
[0092]
(5)转膜
[0093]
①
电泳结束后，将胶取出，放入遇冷的转膜液中，浸泡5min，同时根据胶的大小裁剪适当大小的pvdf膜。
[0094]
②
将pvdf膜放入甲醇中活化30s后，放入转膜缓冲液中。
[0095]
③
在转膜槽中从上至下依次铺上海绵垫、蛋白胶、pvdf膜及海绵垫，后采用半干转的方法将胶上的蛋白转到pvdf膜上。
[0096]
(6)抗体孵育
[0097]
①
转膜结束之后将膜用丽春红染液染2min，然后用水冲洗掉胶上的染液。
[0098]
②
将pvdf膜用tbst漂洗一遍后，放入5％脱脂奶粉封闭液中室温封闭2h。
[0099]
③
按适当浓度配制一抗溶液，并将pvdf膜放入其中，4摄氏度孵育过夜。
[0100]
④
弃去一抗，用tbst清洗3次，每次10min。
[0101]
⑤
按适当浓度配制二抗溶液，并将pvdf膜放入其中，室温孵育2h后，tbst清洗3次，每次10min。
[0102]
(7)显色
[0103]
①
取适量的ecl显色a液及b液按1:1体积混合。
[0104]
②
将混匀的显色液均匀的滴加在pvdf膜表面。
[0105]
③
在暗室中显影，根据发光强度调整曝光时间。
[0106]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。