一种针对绿色荧光蛋白GFP的纳米抗体及其应用的制作方法

本发明属于单域重链抗体、基因工程抗体技术领域(又称纳米抗体技术)，尤其是一种针对绿色荧光蛋白(GFP)的纳米抗体及其应用。

背景技术

绿色荧光蛋白最早是由下村修等人在1962年在水母中发现的，其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围内的光线激发下，会发出绿色荧光。GFP是一段由238氨基酸残基组成的，大小约27KDa，其作用是标记标签，广泛应用于免疫学检测、细胞成像、亲和纯化及蛋白质工程等领域。

目前市场上大部分是针对GFP的单克隆或多克隆抗体用于检测，这种传统意义上的单克隆抗体的研发和生产过程极其繁琐和复杂，且抗体稳定性差、生产成本高，多克隆抗体来源有限。并且传统抗体含有Fc段，容易发生非特异性结合或污染。反观纳米抗体仅由一个结构域组成，因其分子量小，具有亲和力高、稳定性强、组织相容性好及易筛选、易制备等特点，且没有普通抗体的重链和轻链的非特异性结合或污染。用纳米抗体作为配基制备的纯化介质具有成本低、可重复使用等优点，近年来在治疗型药物抗体、临床检测性抗体、科技运用型抗体等方面得到了广泛的研究与发展。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种针对绿色荧光蛋白(GFP)的纳米抗体及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种针对绿色荧光蛋白GFP的纳米抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述纳米抗体的氨基酸序列分为四个框架区和三个互补决定区。

一种编码如上所述的氨基酸序列的核酸分子。

进一步地，所述核酸分子的序列为SEQ ID NO.2。

一种包括如上所述的核酸分子的载体。

一种包括如上所述的载体的宿主细胞。

如上所述的纳米抗体在免疫检测和/或富集纯化绿色荧光蛋白GFP方面中的应用。

如上所述的纳米抗体通过随机或定点突变技术进行改造所获得的能与绿色荧光蛋白GFP特异性结合的抗体。

一种绿色荧光蛋白GFP的免疫亲和吸附材料，所述吸附材料能够以针对绿色荧光蛋白GFP的纳米抗体作为配基，所述纳米抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，具体制备步骤如下：

采用材料载体偶联抗GFP纳米抗体，具体制备方法如下:

将CNBr活化的干胶用0.1M HCl洗涤10次，每次平衡5min；用10mM、NA2HPO4、pH7.2的偶联缓冲液洗涤10次，加入抗GFP标签纳米抗体，加入量为2mg/每克材料载体，室温反应3.5h，使抗GFP标签纳米抗体与CNBr活化的材料载体共价偶联；用10mM、NA2HPO4、pH7.2的偶联缓冲液洗涤3次后，加入封闭液室温反应2h以封闭未反应的活性基团；用6倍胶体积的10mM、pH7.2的磷酸缓冲液和0.1M、pH4.5的醋酸缓冲液交替洗涤3次，得到共价偶联了抗GFP标签纳米抗体的免疫亲和吸附材料；取上述免疫亲和吸附材料置于层析柱中，8～10倍柱体积的10mM、pH7.2的PBS洗涤后，加入20％乙醇溶液，即得免疫亲和吸附材料，4℃保存。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明公开了纳米抗体基因序列及宿主细胞，纳米抗体是一种可以与GFP特异性结合的单域抗体重链抗体(即纳米抗体，下同)，也能够在大肠杆菌内高效表达，可应用于GFP及GFP融合蛋白的纯化及检测。

2、本发明公开的GFP的纳米抗体，能够特异性的结合GFP蛋白，相对于传统的单克隆抗体，此纳米抗体具有较高的亲和力和结合特异性，应用效果更好更广泛，可用于GFP及GFP融合蛋白的结合和检测。

3、本发明所提供的氨基酸序列SEQ ID NO.1可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，获得性质(水溶性、稳定性、亲和力及特异性等)更好的突变体，该突变体能够与GFP特异性结合。

附图说明

图1为本发明中对于所构建的GFP特异性的单域抗体文库进行的菌落PCR电泳图；其中，泳道1是DNA分子标准，泳道2-5是在所构建的GFP纳米抗体文库中随机的挑取克隆，通过菌落PCR检测文库的插入率，计算结果表明文库插入率至100％；

图2为本发明中用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中，1是将载脂蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液；

图3为本发明中表达的GFP纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中，泳道1是蛋白分子标准，泳道2和3是目的蛋白纯化后的SDS-PAGE胶图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种针对绿色荧光蛋白GFP的纳米抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

较优地，所述纳米抗体的氨基酸序列分为四个框架区(Framework region,FR)和三个互补决定区(complementarity determining region,CDR)。

一种编码如上所述的氨基酸序列的核酸分子。

较优地，所述核酸分子的序列为SEQ ID NO.2。通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。

一种包括如上所述的核酸分子的载体。由于遗传密码子具有简并性，该核酸序列可以不同的应用而不同。

一种包括如上所述的载体的宿主细胞。

如上所述的纳米抗体在免疫检测和/或富集纯化绿色荧光蛋白GFP方面中的应用。

如上所述的纳米抗体通过随机或定点突变技术进行改造所获得的能与绿色荧光蛋白GFP特异性结合的抗体。

一种绿色荧光蛋白GFP的免疫亲和吸附材料，所述吸附材料能够以针对绿色荧光蛋白GFP的纳米抗体作为配基，所述纳米抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

较优地，具体制备步骤如下：

采用材料载体偶联抗GFP纳米抗体，具体制备方法如下:

将CNBr活化的干胶用0.1M HCl洗涤10次，每次平衡5min；用10mM、NA2HPO4、pH7.2的偶联缓冲液洗涤10次，加入抗GFP标签纳米抗体，加入量为2mg/每克材料载体，室温反应3.5h，使抗GFP标签纳米抗体与CNBr活化的材料载体共价偶联；用10mM、NA2HPO4、pH7.2的偶联缓冲液洗涤3次后，加入封闭液室温反应2h以封闭未反应的活性基团；用6倍胶体积的10mM、pH7.2的磷酸缓冲液和0.1M、pH4.5的醋酸缓冲液交替洗涤3次，得到共价偶联了抗GFP标签纳米抗体的免疫亲和吸附材料；取上述免疫亲和吸附材料置于层析柱中，8～10倍柱体积的10mM、pH7.2的PBS洗涤后，加入20％乙醇溶液，即得免疫亲和吸附材料，4℃保存。

具体地，相关制备及检测如下：

本发明首先将GFP免疫一只新疆双峰驼，经过4次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了GFP特异的纳米抗体文库。将GFP偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得GFP的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选GFP免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：针对于GFP的纳米抗体文库的构建：

(1)将GFP浓度为500微克每毫升，每次免疫将1毫克GFP与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余几次全部使用弗式不全佐剂，免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。

(2)4次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA，参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。

(3)按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX试剂盒说明书,将提取的RNA反转录成cDNA并利用套式PCR扩增VHH链，第一轮PCR：

上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC

下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，54℃退火，25个循环；

第二轮PCR：

以第一轮PCR产物作模板：

上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段),60℃退火,17个循环,回收目的片段，结果如图1显示，从左到右的DNA条带分别是：第一为100bP的分子Marker，第二纳米抗体基因电泳带约为500bp。

(4)使用限制性的内切酶(购自NEB)PstI及NotI酶切20μgpComb3噬菌体展示载体(Biovector供应)及10μg VHH，并用T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接两个片段。

(5)将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1(北京神州红叶科技有限公司)中，构建GFP的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为1.8*10⁸；与此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结果插入率约100％，图2显示菌落PCR结果。文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机的选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示：即本发明的插入率已达到100％。

实施例2：针对GFP的纳米抗体筛选过程：

(1)将溶解在100毫摩pH 8.2NaHCO3中的GFP200微克偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。

(2)第二天两个孔中分别加入100微升0.1％酪蛋白，室温封闭2小时。

(3)2小时后，加入100μl噬菌体(8*10¹¹tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，在室温下作用1小时。

(4)用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。

(5)用三乙基胺(100mM)将与GFP特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮。在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中GFP特异抗体的目的。该实验的原理模式图如图3所示。

实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：

(1)从上述3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100微克每毫升的氨苄青霉素的TB培养基(1升TB培养基中含有2.3克磷酸二氢钾，12.52克磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1毫摩尔的IPTG，28℃培养过夜。

(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。

(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入一mouse anti-HAtag antibody(抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1小时。

(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置1小时。

(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。

(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。

(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100微克每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终1株抗体。其抗体的VHH链的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1所示，核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：

(1)将前面测序分析所获得两种纳米抗体亚克隆至表达性的载体PET32b中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3中，其涂布在含有100微克每毫升氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37℃过夜，(2)挑选单个菌落接种在15毫升含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，(3)接种1ml的过夜菌种至330mlLB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜，(4)第二天，离心收菌，(5)将菌体破碎以获得抗体粗提液，(6)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液(50毫摩尔，100毫摩尔)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(250毫摩尔，500毫摩尔)最终可制备纯度达90％以上的蛋白。

图3所示从左到右的条带分别是：第一为标准蛋白分子，第二和第三为目的蛋白纯化后的样品。

实施例5 GFP免疫亲和吸附材料的制备

采用琼脂糖微球作为载体(载体材料不限于琼脂糖凝胶，也可以选用硅球、纳米磁珠等。)，偶联抗GFP纳米抗体，具体制备方法如下:

将CNBr活化的干胶用0.1M HCl洗涤10次，每次平衡5min。用偶联缓冲液(10mM，

NA2HPO4，pH7.2)洗涤10次，加入抗GFP标签纳米抗体(2mg/每克琼脂糖微球)，室温反应3.5h,使抗GFP标签纳米抗体与CNBr活化的琼脂糖凝胶微球共价偶联。用偶联缓冲液(10mM,NA2HPO4,pH7.2)洗涤3次后,加入封闭液室温反应2h以封闭未反应的活性基团。用6倍胶体积的磷酸缓冲液(10mM,pH7.2)和醋酸缓冲液(0.1M,pH4.5)交替洗涤3次,得到共价偶联了抗GFP标签纳米抗体的免疫亲和吸附材料。取0.2ml上述免疫亲和吸附材料于容量为1ml的层析柱,8～10倍柱体积的PBS(10mM,pH7.2)洗涤后,加入20％乙醇溶液,4℃保存。

本发明中用到的序列可以如下：

SEQ ID NO.1

QVQQHKSRGGLLEARGSLWHWCRGWGYWCSRCHMMWLRLARGNGPDSVWGPTTGRGPWYYDDPVEAPIHHLPRQRQEHGVSAGVQPGTWPPSHVLLCCPTRFPMGWAPPLAKILWLLGPGDPGHRLL

SEQ ID NO.2

CAGGTGCAGCAGCACAAGTCTCGCGGTGGGTTGCTGGAGGCTCGGGGGTCACTGTGGCACTGGTGTCGAGGCTGGGGATACTGGTGCAGTAGATGCCACATGATGTGGCTGCGGCTGGCTCGAGGGAACGGGCCCGACTCGGTCTGGGGCCCTACAACTGGTCGTGGGCCATGGTACTACGACGACCCCGTGGAGGCGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACATGGTGTATCTGCGGGTGTTCAGCCTGGGACCTGGCCACCCAGCCATGTACTACTGTGCTGCCCGACCAGGTTCCCTATGGGTTGGGCTCCCCCTCTCGCGAAGATTTTATGGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTC

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学 北京兰博利德商贸有限公司

<120> 一种针对绿色荧光蛋白GFP的纳米抗体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> 纳米抗体(Unknown)

<400> 1

Gln Val Gln Gln His Lys Ser Arg Gly Gly Leu Leu Glu Ala Arg Gly

1 5 10 15

Ser Leu Trp His Trp Cys Arg Gly Trp Gly Tyr Trp Cys Ser Arg Cys

20 25 30

His Met Met Trp Leu Arg Leu Ala Arg Gly Asn Gly Pro Asp Ser Val

35 40 45

Trp Gly Pro Thr Thr Gly Arg Gly Pro Trp Tyr Tyr Asp Asp Pro Val

50 55 60

Glu Ala Pro Ile His His Leu Pro Arg Gln Arg Gln Glu His Gly Val

65 70 75 80

Ser Ala Gly Val Gln Pro Gly Thr Trp Pro Pro Ser His Val Leu Leu

85 90 95

Cys Cys Pro Thr Arg Phe Pro Met Gly Trp Ala Pro Pro Leu Ala Lys

100 105 110

Ile Leu Trp Leu Leu Gly Pro Gly Asp Pro Gly His Arg Leu Leu

115 120 125

<210> 2

<211> 381

<212> DNA/RNA

<213> 核酸分子(Unknown)

<400> 2

caggtgcagc agcacaagtc tcgcggtggg ttgctggagg ctcgggggtc actgtggcac 60

tggtgtcgag gctggggata ctggtgcagt agatgccaca tgatgtggct gcggctggct 120

cgagggaacg ggcccgactc ggtctggggc cctacaactg gtcgtgggcc atggtactac 180

gacgaccccg tggaggcgcc gattcaccat ctcccgagac aacgccaaga acatggtgta 240

tctgcgggtg ttcagcctgg gacctggcca cccagccatg tactactgtg ctgcccgacc 300

aggttcccta tgggttgggc tccccctctc gcgaagattt tatggttact ggggccaggg 360

gacccaggtc accgtctcct c 381

<210> 3

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 第一轮PCR上游引物(Unknown)

<400> 3

gtcctggctg ctcttctaca aggc 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 第一轮PCR下游引物(Unknown)

<400> 4

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 5

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 第二轮PCR上游引物(Unknown)

<400> 5

gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29

<210> 6

<211> 35

<212> DNA/RNA

<213> 第二轮PCR下游引物(Unknown)

<400> 6

ggactagtgc ggccgctgga gacggtgacc tgggt 35