一种西红花内生真菌及其在防治球茎腐烂病中的应用

1.本发明涉及植物病害防控技术领域，具体地说，是一种西红花内生真菌及其在防治球茎腐烂病中的应用。


背景技术：

2.西红花是鸢尾科番红花属植物番红花crocus sativus l.的干燥柱头，为浙江省著名道地药材“新浙八味”之一，全株仅雌蕊的三分叉红色丝状柱头可入药，产量低而价值高昂，被喻为“植物黄金”，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效。
3.球茎腐烂病是西红花栽培中的主要病害，高温高湿有利于该病发生，在夏季高温的6月下旬至8月下旬，西红花贮藏期间可造成严重的危害，大田烂球率严重时可达60～70％。由于西红花是三倍体不育植株，仅能通过种球无性繁育，所以西红花球茎的产量和质量直接关系到花的产量，因此球茎腐烂病是制约西红花生产发展的主要障碍之一。西红花球茎腐烂病主要致病菌为肉座菌目，丛赤壳科，镰刀菌属真菌尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)，其侵染植物宿主后，可降解植物细胞壁、改变细胞膜透性、阻止atp合成、抑制植物根的生长。植物细胞壁被降解后，果胶阻塞宿主植物的导管，阻碍宿主植物吸收水分，导致植物萎蔫致死。f.oxysporum主要以菌丝体、厚垣孢子等随寄主病残体在土壤中越冬，厚垣孢子在土壤中至少能够存活5～10年以上，腐烂病防治十分困难。目前对于该病害的防治方法在实际生产中依然多用化学药液(主要为多菌灵等)喷灌或溴甲烷熏蒸土壤，但存在环境污染、致病菌抗药性等问题。
4.植物内生真菌(endophytic fungus)是指生活在植物细胞中或在其生活史某一时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害的一类真菌。广义而言，还包括那些在生活史中的某一阶段表面营生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原真菌和菌根真菌。植物内生真菌是一个特殊的生物类群，分布广、种类多，无论从宿主植物种类，还是自身种类、遗传以及生态环境等多方面都具有极其丰富的生物多样性。内生真菌与宿主植物间的关系非常复杂，有别于寄生、病原和腐生等关系，通常被认为是互利共生关系，一方面，宿主为内生真菌提供生长需要的场所及养分，另一方面，内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用。研究表明，内生真菌的存在可以增强植物对某些病原微生物的抗病能力，内生真菌是植物防控技术领域重要的微生物资源。
5.但是，关于通过西红花内生真菌防治球茎腐烂病的应用目前还未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种西红花内生真菌及其在防治西红花球茎腐烂病中的应用。
7.本发明的第一方面，提供了一种药用植物内生真菌，属于多孔菌目，多孔菌科，栓菌属真菌，分类命名为变色栓菌cs05(trametes versicolor)。所述的内生真菌是从鸢尾科番红花属植物西红花(crocus sativus l.)活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得
的，经微生物分类学鉴定为变色栓菌cs05(trametes versicolor)。该菌株已保藏，菌株保藏编号为cgmcc no.21948，保藏日期为2021年4月9日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
8.本发明所述的内生真菌的固体培养特征为：
9.在土豆葡萄糖琼脂培养基(pda)上28℃暗培养，生长较快，菌落呈白色圆形，凸起，干燥、可见细长菌丝，中间紧密，边缘稀薄，隐约可见同心环带，见图1。
10.本发明所述的内生真菌在显微镜下的形态特征为：菌丝体透明、薄壁，扭曲，有分支，表面多平滑，见图2。
11.本发明所述的内生真菌的its扩增电泳图见图3，its分子序列如seq id no.1所示。
12.将测序结果于ncbi网站进行序列比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，同trametes versicolor(mw742535)、trametes versicolor(mw742533)、trametes versicolor(y950437)的序列同源性均达99.33％。用mega7.0做多序列比对，用邻接法(neighbor
‑
joining，nj)分析，随机挑取1个序列，重复比对1000次。本发明所述内生真菌的系统进化树见图4。
13.本发明的第二方面，提供了上述内生真菌孢子悬浮液在防治西红花球茎腐烂病中的应用。
14.所述的上述应用，施用cs05真菌孢子悬浮液能有效缓解西红花球茎腐烂病病情，所述真菌孢子悬浮液是在pdb液体培养基中振荡发酵，无菌纱布过滤所得，pdb液体培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水，ph自然。
15.上述应用，主要是通过以下技术方案来实现的：(1)取cs05在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的土豆葡萄糖培养基(配方为土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph自然)，28℃，60％湿度条件下暗培养7d；(2)无菌条件下，用直径5mm经灭菌的打孔器在菌落边缘打取菌饼，取100块菌饼接种于1000ml已灭菌的pdb培养基中，在28℃，180rpm条件下振荡培养7d。用灭菌纱布过滤，无菌pdb溶液定容至10ml容量瓶；(3)无菌条件下，吸取100μl孢子悬浮液，用血球计数板调整孢子浓度至105个孢子/ml即得；(4)取健康的西红花球茎240个，随机分为5组，进行假手术处理、无菌pdb处理、f.oxysporum处理、f.oxysporum预先处理3d后+cs05处理、f.oxysporum预先处理3d后+阳性菌哈茨木霉trichoderma harzianum处理。采用针刺注射的方式对西红花球茎施用所述孢子悬浮液，施用量为30μl/次/3d，共培养30d，能明显观察到cs05能有效缓解西红花腐烂病病情。
16.本发明优点在于：
17.本发明所述的西红花内生真菌变色栓菌trametes versicolor cs05，通过pdb液体培养基制备的活体真菌孢子悬浮液，能有效缓解西红花球茎腐烂病病情，降低病情指数81.13％。本发明的内生真菌对西红花腐烂病防治效果明显，为西红花真菌类病害的生物防治领域带来广阔的应用前景
附图说明
18.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
19.图1：变色栓菌cs05(trametes versicolor)在pda固体培养基上的菌落形态；
20.图2：变色栓菌cs05(trametes versicolor)在光学显微镜下的菌丝形态；
21.图3：基于its5和its4引物扩增的cs05(trametes versicolor)its序列凝胶电泳图；
22.图4：基于its的变色栓菌cs05(trametes versicolor)系统进化树(nj法)；
23.图5：变色栓菌cs05(trametes versicolor)制备的活体真菌孢子悬浮液；
24.图6：变色栓菌cs05(trametes versicolor)对西红花腐烂病病原菌菌丝生长的抑制作用；其中，图a为cs05对病原菌尖孢镰刀菌f.oxysporum菌丝生长的抑制作用，t1为cs05、t3为f.oxysporum、t2为cs05与f.oxysporum共培养组，中心处为cs05对峙后的病原菌形态；图b抑菌率实验结果图；
25.图7：变色栓菌cs05(trametes versicolor)有效缓解西红花球茎腐烂病病情；其中，图a为球茎表型；图b为病情指数结果；
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p<0.001。
具体实施方式
26.本发明的内生真菌是从浙江杭州建德产西红花活体中分离得到的菌株。
27.实施例1：
28.所述内生真菌按以下步骤分离获得：取新鲜西红花植株，在清水下冲洗去除表面杂质。剪取适宜大小组织部位(顶芽、球茎、花、叶、膜质包被)，包裹纱布后进行三步表面消毒处理，75％乙醇溶液1min，1％次氯酸钠溶液3min，75％乙醇溶液30s。消毒取出，剪取组织中间部分约0.5cm
×
0.5cm大小的小块接种于培养用平板中，每皿4块。封口膜密封，编号记录，室温下培养7
‑
14d。定期观察菌落的生长情况，根据其菌群形态和颜色等筛选出目标单一的菌落。在无菌条件下，挑取目标菌丝尖端组织块转移至新鲜制备的pda培养皿中再次培养，编号记录，待培养完成后，再次观察筛选，挑选出合适菌落，取菌落边缘菌丝接于新的平板，不断重复筛选、挑取及培养来纯化菌株，最终从球茎部位分离得到本发明的内生真菌菌株cs05，如图1所示，菌落呈白色圆形，凸起，干燥、可见细长菌丝，中间紧密，边缘稀薄，隐约可见同心环带，在显微镜下(图2)菌丝体透明、薄壁，扭曲，有分支，表面多平滑，并于低温保存(4℃)。
29.取cs05菌株冻存管，在无菌条件下，用接种针挑取少许菌丝置于新制的pda培养基中活化，28℃遮光培养至成熟，用以its序列扩增及分子鉴定。按照改良ctab法提取菌株dna，应用引物its5和its4对其its序列进行pcr扩增。pcr反应循环参数扩增步骤：1、95℃，3min，初始变性；2、94℃，40s，变性；3、52℃，50s，退火；4、72℃，1min，延伸；5、2
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4重复循环35次；6、72℃，10min，扩展。将经琼脂糖凝胶电泳检测后的pcr产物送至上海生工公司进行序列测定。以pcr产物测得序列作为靶序列，在ncbi中的genbank数据库搜索同源序列，下载与形态型序列最相似的参考序列，用邻接法(neighbor
‑
joining，nj)用于系统发育分析，来确定待鉴定菌株的系统发育地位，如图3、4所示。本发明的内生真菌菌株同trametes versicolor(mw742535)、trametes versicolor(mw742533)、trametes versicolor(y950437)的序列同源性均达99.33％，属于多孔菌目多孔菌科栓菌属，分类命名为变色栓菌cs05(trametes versicolor)，保藏编号为cgmcc no.21948。
30.实施例2：
31.取cs05菌株冻存管，在无菌条件下，用接种针挑取少许菌丝置于新制的pda培养基
中活化，28℃遮光培养至成熟；取西红花腐烂病病原菌尖孢镰刀菌f.oxysporum，用真菌打孔器将成熟菌落打成0.5cm
×
0.5cm的菌饼，病原菌放至中心位置，以120
°
的夹角划线，将cs05接种至离中心点2cm位置，进行平板对峙试验。结果发现内生真菌cs05在离体条件下能有效抑制西红花腐烂病病原菌尖孢镰刀菌f.oxysporum的生长，相对抑制率为76.53％，高于哈茨木霉，如图6所示。
32.取cs05菌株冻存管，在无菌条件下，用接种针挑取少许菌丝置于新制的pda培养基中活化，28℃遮光培养至成熟；无菌条件下，用直径5mm经灭菌的打孔器在菌落边缘打取菌饼，取100块菌饼接种于1000ml已灭菌的pdb培养基中，在28℃，180rpm条件下振荡培养7d得到发酵液；用灭菌纱布过滤，无菌条件下，吸取100μl孢子悬浮液，用血球计数板调整孢子浓度至105个孢子/ml，无菌水定容至10ml容量瓶，即得cs05孢子悬浮液(图5)；取健康的西红花球茎240个，随机分为5组，处理组采用针刺注射法预先注射病原菌f.oxysporm孢子悬浮液(105个孢子/ml)3d后，施用cs05孢子悬浮液，施用量为30μl/次/3d，共培养30d，同时设置假手术组(仅针刺处理)和无菌pdb组、单独f.oxysporm处理组、阳性菌哈茨木霉t.harzianum组作为空白对照、阴性对照、阳性对照，n＝50。调查统计西红花病球数、发病率、病变面积，用血球计数法检测病原菌数量，并计算病情指数(di)＝[∑(病级株数
×
代表数值)/株数总和
×
发病最高级代表数值]
×
100。发现施用cs05孢子悬浮液可以缓解西红花球茎腐烂病病情，相比球茎腐烂病模型组病情指数降低81.13％，如图7所示。
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以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。