一种RNA酶解液的预处理方法与流程

一种rna酶解液的预处理方法
技术领域
1.本发明涉及核苷酸产品技术领域，具体涉及一种rna酶解液的预处理方法。


背景技术：

2.将核糖核酸(rna)通过核酸酶p1或磷酸二酯酶酶解反应，再经过阴离子交换树脂层析分离再分别浓缩、结晶、干燥，可以制得腺苷酸(amp)、鸟苷酸(gmp)、胞苷酸(cmp)和尿苷酸(ump)等4种单一核苷酸产品。
3.在应用阴离子交换树脂层析分离时，由于rna和酶等含有色素、蛋白质等杂质，会使树脂色泽变深，交换性能降低。一般树脂在使用10批后，会使原来浅黄色的树脂变成褐色，上样交换核苷酸容量下降10％；树脂在使用20批后，树脂变成深褐色，上样交换核苷酸容量下降20％；树脂在使用30批后，树脂成为黑褐色，上样交换核苷酸容量下降30％以上。并且分离效果越来越差。如不采取措施，必须更换新树脂。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种rna酶解液的预处理方法。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种rna酶解液的预处理方法，其创新点在于，包括以下步骤：
6.s1、rna溶解液：总体积6l，其中rna用量2％，固体酶用量5％和硫酸锌用量0.5％；
7.s2、rna反应：分别取两组3l的rna溶解液，再分别进行rna反应，反应温度为70
‑
72℃，反应时间3h，然后在反应时间2.5h和3h取样，并进行hplc检测反应转化率；
8.s3、rna反应液预处理：
9.1)板框过滤：将其中一组3l的rna溶解液通过硅藻土过滤，得到过滤液；
10.2)微滤：将板框过滤液通过0.25um或0.5um微滤膜进行微滤，得到滤液；
11.3)超滤：滤液进超滤机，设定超滤机的膜分子量分别为3000、6000、10000、20000，泵压力为0.2
‑
0.6mpa进行超滤，且每个膜分子量分别超滤20
‑
50min，同时在超滤时间范围内多次随机取样超滤液和排废液；
12.4)检测：检测过滤液、超滤液和排废液的紫外吸收波长a250、a260、a280、a430，并计算浓度c；
13.5)阳树脂：超滤液经过阳离子交换树脂，通过流速sv1；
14.rna反应液中主要存在的杂质主要包括：大分子变性的蛋白质、颗粒性杂质、色素、可溶性蛋白、钙、镁、锌离子等；rna反应液预处理方法：1)板框过滤和微滤，主要去除变性的蛋白质和颗粒物质。2)超滤：主要是去掉可溶性蛋白质和部分色素分子。3)阳离子交换树脂：主要去掉钙、镁、锌等离子；
15.s4、rna上样：将超滤液和rna反应液分别上样，漏出浓度c≥0.4g/l，且上样液浓度和漏出液浓度的比值2≥1，判定为上样漏穿，记录上样量和上样体积。
16.进一步的，所述微滤的孔径为0.25um或0.5um微滤。
17.进一步的，所述超滤的流量为100
‑
200ml/min。
18.本发明有益效果为：
19.1、本发明通过板框过滤、微滤、超滤、阳树脂等一系列预处理组合，可以去除rna和酶等原料中含有的大分子蛋白质、颗粒杂质、色素、可溶性蛋白质、钙、镁、锌离子等杂质，减少了吸附到阴离子交换树脂上的杂质，有效的保护了阴离子交换树脂，从而延长了阴离子交换树脂的寿命。
20.2、本发明rna反应液超滤后杂质的减少使4种核苷酸在树脂上的分布更加均匀，在洗脱的过程中，更好的出现一个个层析带，更加有利于4种核苷酸的分离效果。
21.3、本发明超滤去掉了rna反应液中的大分子的杂质，在上样过程中减少了大分子物质吸附在阴离子交换树脂上，从而有更多的核苷酸吸附在阴离子交换树脂上，所以增加了核苷酸的交换容量。
附图说明
22.图1为本发明中rna溶解液的hplc检测反应转化率分析报告一；
23.图2为本发明中rna溶解液的hplc检测反应转化率分析报告二。
具体实施方式
24.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
25.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
26.本发明经过大量实验，最终应用板框过滤、微滤和超滤等方法解决了上述问题。rna酶解液一般要升温至85
‑
90℃，使酶变性，然后冷却至45℃以下板框过滤，去除颗粒性和变性蛋白等杂质，此时溶液中还存在色素、可溶性蛋白等杂质。本发明的做法是将此板框过滤清夜先通过0.25um或0.5um微滤，然后再经过超滤，分别使用3000、6000、10000、20000分子量的超滤膜超滤，最后经过阳树脂去除钙、镁、锌等离子，得到杂质和色素量少的rna反应液。
27.对两组rna溶解液进行hplc检测反应转化率的分析报告见图1和图2，且从图1和图2中可以看出，通过hplc检测，rna溶解液反应转化率2.5h为67.71％，3h为69.15％，说明反应过程正常。
28.实施例1
29.取反应液001，见表一：
30.名称a430浓度c吸附量备注反应液0011.08332.751体积3l
31.表一
32.反应液001分别在(分子量为3000d、泵压力0.2mpa)、(分子量为6000d、泵压力0.2mpa)、(分子量为10000d、泵压力0.2mpa)、(分子量为20000d、泵压力0.2mpa)进行实现，并得到以下数据，见表二：
33.分子量泵压力a430浓度c时间吸附量交换吸附增加量分离度3000d0.2mpa0.39025.2950min1.1818％提高6000d0.2mpa0.45528.3542min1.1313％提高10000d0.2mpa0.62229.5830min1.088％提高20000d0.2mpa0.92130.1224min1.055％无变化
34.表二
35.综上所述，通过不同分子量的超滤膜3000d、6000d、10000d、20000d分子量的超滤膜可以看出：3000d的超滤膜进行超滤3l rna溶解液，并进行吸附测定，可以得出结论：通过超滤可以去掉色素，去除率达64％，可以增加吸附量，增加约18％，去色素和增加吸附性能能力较好；6000d的超滤膜进行超滤3l rna溶解液，并进行吸附测定，可以得出结论：通过超滤可以去掉色素，去除率达56％，可以增加吸附量，增加约13％；10000d的超滤膜进行超滤3l rna溶解液，并进行吸附测定，可以得出结论：通过超滤可以去掉色素，去除率达43％，可以增加吸附量，增加约8％；2000d的超滤膜进行超滤3l rna溶解液，并进行吸附测定，可以得出结论：通过超滤可以去掉色素，去除率达15％，可以增加吸附量，增加约5％，去掉色素和增加吸附的效果比较差。
36.通过超滤实验及吸附性能测定实验可以得出结论，超滤可以去除色素、蛋白质等大分子杂质，提高树脂对核苷酸的吸附性能，保护树脂。
37.实施例2
38.过滤液进超滤机，设定超滤机的膜分子量分别为3000d，泵压力为0.2mpa进行超滤，且分别超滤10、20、30、40、50min，同时在超滤时间范围内取样超滤液和排废液，检测过滤液、超滤液和排废液的紫外吸收波长a250、a260、a280、a430，并计算比值a250/a260(比值1)和a80/a260(比值2)和浓度c；
39.rna反应液超滤(以3000分子量为例)，见表三：
40.名称a250a260a280比值1比值2浓度ca430反应液0020.4050.4830.3070.840.6432.751.083超滤10min0.6700.8050.5020.830.6227.290.481超滤20min0.3350.4010.2520.840.6327.190.517超滤30min0.3360.4030.2520.830.6327.320.559超滤40min0.4110.4920.3080.840.6333.360.619超滤50min0.3710.4430.2780.840.6330.030.749排废液0.1630.1870.1230.870.6612.683.05
41.表三
42.综上所述，小试rna反应液超滤可以去掉约50％
‑
60％色素量。
43.实施例3
44.将超滤液和rna反应液分别上样，漏出浓度c≥0.4g/l，且上样液浓度和漏出液浓度的比值2≥1，判定为上样漏穿，记录上样浓度、上样量、和上样时间等，并计算上样提高量，见表四：
[0045][0046]
表四
[0047]
综上所述，小试rna反应液超滤上样量增加均大于10％，最高可提高18％。
[0048]
实施例4
[0049]
超滤机操作流程：
[0050]
1、实验前冲洗：
[0051]
将压力调节阀开度调节到最大，关闭左侧放料阀门，向物料罐中添加1l纯化水，启动物料泵，透过液回流至物料罐中，逐步调节压力调压阀，调节入膜压力至0.1～0.4mpa，循环2min后记录温度、入膜压力、膜通量；冲洗完毕后，将压力调节阀开度调节到最大，打开放料阀把循环水放掉。
[0052]
2、进行实验：
[0053]
1)将压力调节阀调节到开度最大，关闭放料阀，将实验料液加入物料罐中。
[0054]
2)启动物料泵，料液开始循环，在膜元件表面高速流动，不加压条件下循环2
‑
5min，顺时针缓慢调小调压阀开度，提高入膜压力至实验压力(微滤膜≤0.2mpa；超滤膜≤0.7mpa；纳滤膜≤1.0mpa)，按工艺要求收集/排放透过液，以达到相应的实验目的。为提高通量一般要调整调压阀的开度，在过滤速度能够满足的条件下，尽量选用较小的过滤压力，减缓膜元件的使污染速度，切勿将调压阀全部关闭以造成膜面污损等不可挽回的后果。
[0055]
3)随着实验的进行，物料罐内液位会下降，根据实验需求决定是否需要向物料罐中补充料液，如设备运行时间过长，应注意防止物料浓度过高析出堵塞膜元件；设备运行期间调整好膜面压力，做好参数记录。
[0056]
4)当实验完毕或其他异常需停机时，将调压阀逆时针方向调整到开度最大，不加压条件下循环2
‑
5min，打开放料阀，按工艺要求收集/排放浓缩液，当物料收集或排放完成后关闭物料泵，停止设备运行。
[0057]
5)实验结束后应立即清洗膜芯或用纯水冲洗膜芯。
[0058]
3、物料漂洗：
[0059]
将压力调节阀调节到开度最大，打开放料阀，向物料罐内加纯化水，启动物料泵，开始进行设备冲洗，冲洗完毕，根据实际情况决定冲洗液处理去向(收集或者排放)，关闭物料泵。关闭放料阀，再次用纯水冲洗设备，调节阀调节到开度最大，循环清洗3
‑
5min冲洗膜
面，再调整调压阀的开度，适当调高压力清洗膜面及透过侧管路，将设备内循环液排放后关闭设备。
[0060]
设备名称：有机膜分离实验机
[0061]
设备型号：bona
‑
gm
‑
18
[0062]
制造商：山东博纳生物科技集团有限公司
[0063]
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。