一种螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取方法与流程

1.本发明属于食品生物技术领域，尤其涉及一种螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取方法。


背景技术：

2.螺旋藻是一类利用太阳能固定二氧化碳的光能自养水生植物，营养价值高。螺旋藻细胞含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和脂肪酸等，已被开发为多种保健食品。这其中，藻蓝蛋白和藻油具有更高的经济价值而得到广泛研究。藻蓝蛋白是一种胞内蛋白，水溶性好，呈现亮蓝色，具有抗氧化、清除自由基等功效，在食品、化妆品和制药工业都已得到广泛应用；藻油，泛指藻类细胞内形成的疏水性脂质，是一类重要的生物质绿色能源。
3.提取分离藻蓝蛋白或者藻油的方法有很多报道，如用于藻蓝蛋白提取的盐析、色谱分离和双水相萃取等技术(俞丽燕.藻蓝蛋白的性质和提取技术研究进展.福建轻纺,2020(05))，和用于藻油提取的有机溶剂萃取、硫酸水解和超临界萃取等技术(刘艺琳,陈弘培,龚世禹,潘雨阳,曾峰,刘斌.微藻油的提取与功能研究进展.食品工业科技,2019,40(05))。然而，现有技术未见同步提取藻蓝蛋白和藻油的技术报道，这主要是因为藻蓝蛋白呈水溶性而藻油为疏水性，现有的萃取等技术对同步提取藻蓝蛋白和藻油存在不兼容性。例如，利用有机溶剂或者硫酸提取藻油时，藻蓝蛋白容易放生变性导致生物活性丧失；而利用双水相萃取技术提取藻蓝蛋白时，藻油由于疏水性较强无法溶解到藻蓝蛋白水溶液中而被遗弃在细胞碎片里。
4.非离子表面活性剂的水溶液在一定温度下可形成极性不同的两相，可用于萃取分离疏水性化合物。发明专利申请cn 101269275a报道了一种聚乙二醇(peg)诱导形成的浊点系统可用于分离水溶液中的不挥发有机溶剂，发明专利申请cn 103190522a报道了一种从芝麻中提取蛋白质的方法，利用浊点系统去除疏水杂质而得到了高纯度的蛋白质。表面活性剂形成的浊点系统被广泛应用目标产物的分离，然而，未见利用浊点系统从螺旋藻样品同步提取亲水性藻蓝蛋白和疏水性藻油的技术报道。
5.因此，提供一种螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取方法具有重要意义。


技术实现要素：

6.为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取方法，实现螺旋藻藻蓝蛋白和藻油这两种物质的同步提取，效率高，能耗低，环境效益好。
7.本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
8.本发明提供一种螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取方法，包括以下步骤：
9.s1：取聚乙二醇
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聚丙二醇
‑
聚乙二醇嵌段聚合物配制成质量浓度为5％～20％的嵌段聚合物水溶液，备用；
10.s2：取螺旋藻藻粉加入到所述嵌段聚合物溶液中，振荡或搅拌均匀，得到藻粉浸润液；
11.s3：将所述藻粉浸润液利用超声波法破碎螺旋藻细胞；
12.s4：取超声后的溶液，在5～20℃下恒温振荡进行低温萃取；
13.s5：将低温萃取后的溶液提高温度至25～30℃，离心进行相分离，水溶性的藻蓝蛋白处于中间层水相，疏水性的藻油在上层聚合物相；
14.s6：转移所述上层聚合物相至分液漏斗中，加入氯化钠后，提高温度至55～65℃，静置，溶液分层为：上层油相、中间层氯化钠盐溶液相和下层聚合物浓缩相；收集上层油相，得到提纯分离的螺旋藻藻油；
15.转移所述中间层水相至截留分子量为12～15ku的透析袋中，透析纯化后的浓缩液，超低温冷冻，再经真空冷冻干燥，得到螺旋藻藻蓝蛋白。
16.上述嵌段聚合物的组成及其浓度，是通过大量试验筛选确定的优选方案。使用聚乙二醇
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聚丙二醇
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聚乙二醇嵌段聚合物(peg
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ppg
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peg)，可在特定浓度和温度条件下形成浊点系统，实现螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取分离，且收率较高；嵌段聚合物水溶液的浓度也对藻油的萃取和分离具有重要影响，当peg
‑
ppg
‑
peg的质量浓度低于5％时，藻油萃取效率会明显降低，而高于20％时，则分相体积太大，不利于藻油的分离。5～20℃下低温萃取，有利于形成浊点系统，然后提高温度至25～30℃，便于进行浊点相分离，如果温度低于25℃的话，则很难进行分相。步骤s5中，藻油被萃取到peg
‑
ppg
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peg的凝聚层相中，整体密度比较小，所以在上层；s6中加入氯化钠后，peg
‑
ppg
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peg相中的水被氯化钠夺走，形成盐析作用，提高温度至55～65℃可以提高相分离效率，peg
‑
ppg
‑
peg含水量降低后，藻油分离出来飘在上层，peg
‑
ppg
‑
peg就沉在了下相，氯化钠盐溶液密度中等，处于中间层。
17.优选地，所述聚乙二醇
‑
聚丙二醇
‑
聚乙二醇嵌段聚合物的平均分子量为2700～2900。
18.优选地，所述氯化钠的加入量为上层聚合物相质量的5％～10％。
19.优选地，所述超声波法的条件为：冰浴、超声波功率80～1000w，持续超声3～30min。
20.优选地，所述恒温振荡的时间为30～60min。
21.优选地，所述离心的条件为：3000～4000rpm下离心8～10min。
22.优选地，所述超低温冷冻的温度为
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85～
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60℃。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
24.(1)提取前，藻粉无需预处理，节省操作步骤，缩短操作周期。
25.(2)本发明方法实现了螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步分离，效率高，能耗低，环境效益好。
26.(3)与有机溶剂提取相比，本发明方法不使用有机溶剂，环境友好；与双水相提取法相比，本发明方法中的藻蓝蛋白所在水相不使用盐，避免了蛋白质变性；与超临界流体萃取相比，本发明方法没有高压过程，条件温和，设备要求低，能源消耗成本低。
27.(4)peg
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ppg
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peg嵌段聚合物可重复利用，减少浪费，原料成本低，适合工业化推广。
附图说明
28.图1本发明方法的过程示意图。
29.图2本发明方法中藻蓝蛋白的紫外可见全波长扫描图谱；未提纯指步骤s5的中间层水相的藻蓝蛋白，提纯后指透析纯化后的浓缩液的藻蓝蛋白。
具体实施方式
30.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
31.本发明中，peg
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ppg
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peg的商品名为聚醚，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号为：p131344。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
32.实施例一 螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取方法
33.一种螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取方法，包括以下步骤：
34.s1：取聚乙二醇
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聚丙二醇
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聚乙二醇(peg
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ppg
‑
peg)嵌段聚合物配制成质量浓度为10％的嵌段聚合物水溶液，备用；
35.s2：取5g螺旋藻藻粉加入到1l所述嵌段聚合物溶液中，匀速振荡10min，得到藻粉浸润液；
36.s3：将所述藻粉浸润液利用超声波法破碎螺旋藻细胞；超声波法的条件为：冰浴、超声波功率800w，持续超声10min；
37.s4：取超声后的溶液，在10℃下恒温振荡45min进行低温萃取；
38.s5：将低温萃取后的溶液提高温度至25℃，4000rpm下离心8min进行相分离，水溶性的藻蓝蛋白处于中间层水相，疏水性的藻油在上层聚合物相；螺旋藻细胞碎片沉淀在离心管底部，可直接舍弃；
39.s6：转移所述上层聚合物相至分液漏斗中，加入上层聚合物相质量的8％的氯化钠后，提高温度至60℃，静置20min，溶液分层为：上层油相、中间层氯化钠盐溶液相和下层聚合物浓缩相；收集上层油相，得到提纯分离的螺旋藻藻油；下层聚合物浓缩相可回收，再重复利用；转移所述中间层水相至截留分子量为13ku的透析袋中，透析纯化后的浓缩液，
‑
65℃超低温冷冻，再经真空冷冻干燥，得到螺旋藻藻蓝蛋白。过程示意图如图1所示。分别将步骤s5的中间层水相、透析纯化后的浓缩液使用紫外可见分光光度计，进行藻蓝蛋白全波长扫描，结果如图2所示。
40.螺旋藻藻油的提取率98.2％；藻蓝蛋白在620nm有特征吸收峰，而280nm是普通蛋白的吸收峰，其比值与藻蓝蛋白的含量呈正比，藻蓝蛋白的纯度a620/a280为2.05，提取率为94.5％。
41.实施例二 螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取方法
42.一种螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取方法，包括以下步骤：
43.s1：取聚乙二醇
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聚丙二醇
‑
聚乙二醇嵌段聚合物配制成质量浓度为15％的嵌段聚合物水溶液，备用；
44.s2：取8g螺旋藻藻粉加入到1l所述嵌段聚合物溶液中，匀速振荡12min，得到藻粉浸润液；
45.s3：将所述藻粉浸润液利用超声波法破碎螺旋藻细胞；超声波法的条件为：冰浴、超声波功率1000w，持续超声15min；
46.s4：取超声后的溶液，在15℃下恒温振荡50min进行低温萃取；
47.s5：将低温萃取后的溶液提高温度至28℃，3800rpm下离心9min进行相分离，水溶性的藻蓝蛋白处于中间层水相，疏水性的藻油在上层聚合物相；
48.s6：转移所述上层聚合物相至分液漏斗中，加入上层聚合物相质量的6％的氯化钠后，提高温度至58℃，静置18min，溶液分层为：上层油相、中间层氯化钠盐溶液相和下层聚合物浓缩相；收集上层油相，得到提纯分离的螺旋藻藻油；
49.转移所述中间层水相至截留分子量为14ku的透析袋中，透析纯化后的浓缩液，
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70℃超低温冷冻，再经真空冷冻干燥，得到螺旋藻藻蓝蛋白。
50.藻油的提取率93.76％；藻蓝蛋白的纯度为2.18，提取率为96.27％。
51.实施例三 peg
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ppg
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peg回收再利用对藻蓝蛋白和藻油提取率的影响
52.s1：根据实施例1所述方法提取藻蓝蛋白和藻油，藻蓝蛋白和藻油的提取率如表1所示；
53.s2：回收s1中的peg
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ppg
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peg嵌段聚合物后，根据实施例1所述方法，将s1中的peg
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ppg
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peg嵌段聚合物替换为第一次回收peg
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ppg
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peg聚合物后，用于提取藻蓝蛋白和藻油。称重藻蓝蛋白和藻油后，按照公式1计算首次回收聚合物对藻蓝蛋白和藻油的提取率的影响。
[0054][0055]
s3：回收s2中的peg
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ppg
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peg嵌段聚合物后，根据实施例1所述方法，将第一次回收peg
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ppg
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peg聚合物替换为第二次回收peg
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ppg
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peg嵌段聚合物后，用于提取藻蓝蛋白和藻油。称重藻蓝蛋白和藻油后，按照公式1计算二次回收聚合物对藻蓝蛋白和藻油的提取率的影响；
[0056]
s4：回收s3中的peg
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ppg
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peg嵌段聚合物后，根据实施例1所述方法，将第二次回收peg
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ppg
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peg嵌段聚合物替换为第三次回收peg
‑
ppg
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peg嵌段聚合物后，用于提取藻蓝蛋白和藻油。称重藻蓝蛋白和藻油后，按照公式1计算三次回收聚合物对藻蓝蛋白和藻油的提取率；
[0057]
对比新鲜peg
‑
ppg
‑
peg嵌段聚合物和回收peg
‑
ppg
‑
peg嵌段聚合物对藻蓝蛋白和藻油的提取率，结果如表1所示。
[0058]
表1 全新和回收的peg
‑
ppg
‑
peg聚合物对藻蓝蛋白和藻油的提取率
[0059][0060][0061]
随着peg
‑
ppg
‑
peg嵌段聚合物回收次数的增加，藻蓝蛋白和藻油的提取率略有下
降，但并不明显。第三次回收的聚合物，也能维持藻蓝蛋白和藻油的提取率分别在95％和90％以上。提取率的降低可能与提取过程中，peg
‑
ppg
‑
peg嵌段聚合物在水相中的少量损失有关。因此，在推广应用过程中，适量向回收peg
‑
ppg
‑
peg嵌段聚合物中补充新鲜嵌段聚合物，将有利于维持藻蓝蛋白和藻油的高提取率，而多次回收再利用，也能在减少浪费的同时极大降低提取成本。
[0062]
实施例四 不同提取剂对螺旋藻藻油和藻蓝蛋白的提取效果比较
[0063]
为证明本发明方法的提取效果，发明人设计了实施例1的提取方法与基于其他聚合物提取方法的对比实验。
[0064]
实验组：提取剂采用本发明的peg
‑
ppg
‑
peg嵌段聚合物，实验步骤参考实施例1；
[0065]
对比组1：提取剂采用聚环氧乙烷
‑
嵌段
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聚环氧丙烷
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嵌段
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聚环氧乙烷(peo
‑
ppo
‑
peo)嵌段聚合物l62，属于泊洛沙姆嵌段聚合物类，为常规市售产品。实验步骤参考实施例1；
[0066]
对比组2：提取剂采用曲拉通114(triton x
‑
114)，属于聚氧乙烯单叔辛基苯基醚类，为常规市售产品。实验步骤参考实施例1。
[0067]
对比组2与实验组、对比组1不同的是，提取剂萃取分离藻油和藻蓝蛋白时，peg
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ppg
‑
peg和peo
‑
ppo
‑
peo相处于上相，而triton x
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114相由于比重较大而处于下相。
[0068]
实验组与对比组1、对比组2的实验结果如表2所示：
[0069]
表2 不同提取剂对螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的提取率
[0070][0071]
与peg
‑
ppg
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peg嵌段聚合物相比，peo
‑
ppo
‑
peo和triton x
‑
114对藻蓝蛋白和藻油的提取率都明显下降。其中，peo
‑
ppo
‑
peo对藻油提取效率略好，但藻蓝蛋白提取率明显偏低；triton x
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114适合提取藻蓝蛋白，但藻油提取率很低。可见，以peg
‑
ppg
‑
peg嵌段聚合物作为本发明的提取剂，配合本发明的方法，可实现螺旋藻藻蓝蛋白和藻油的同步提取，操作简便、安全、提取率高、成本低，易于推广。
[0072]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。