一种酶催化半合成罗汉果甜苷V的方法与流程

一种酶催化半合成罗汉果甜苷v的方法
技术领域
1.本发明涉及罗汉果甜苷的半合成方法，具体涉及一种酶催化半合成罗汉果甜苷v的方法。


背景技术：

2.罗汉果甜苷作为甜味剂是安全无毒的，在国家强制标准《gb2760食品添加剂使用标准》中规定，罗汉果甜苷可不限量用于各类食品。
3.罗汉果甜苷v(mogroside v)，分子式：c
60
h
102
o
29
，分子量:1287.43，是罗汉果中特有的一种葫芦烷型四环三萜皂苷，是罗汉果中主要的甜味成分，属低热量、非营养、非发酵型的天然高倍甜味剂。
4.11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v，又名：11
‑
氧基
‑
罗汉果甜苷v(11
‑
oxo
‑
mogroside v)，分子式：c
60
h
100
o
29
，分子量:1285.43，同样是罗汉果中特有的一种葫芦烷型四环三萜皂苷，同样是一种天然甜味剂，但是其甜度低于罗汉果甜苷v。
5.11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v与罗汉果甜苷v的四环三萜骨架、取代糖基的数目与位置完全一致，只是11位碳原子上的取代基不同，一个是羰基，一个是羟基。分子结构的细微差别，导致了两者甜度的巨大悬殊：罗汉果甜苷v的甜度是蔗糖的300
‑
400倍，而11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v的甜度是蔗糖的50
‑
60倍。
6.目前，罗汉果提取物产品质量规格的衡量标准，通常是以罗汉果甜苷v的含量作为指标(即：罗汉果甜苷v的含量越高，价值越高)，并未对11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v的含量做限定和要求。因此，11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v在罗汉果提取物中存在的有与无，多与少，都与产品的实际价值毫不相关。通常情况下，在罗汉果原料中，11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v的含量大约是罗汉果甜苷v含量的10％～20％，除罗汉果甜苷v之外，它还是罗汉果总皂苷中含量最高的皂苷。因此通过有效的途径，用11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v作为起始原料，半合成罗汉果甜苷v具有重大意义。
7.发明人于2019年曾申请了如下两篇与罗汉果甜苷v半合成有关的发明申请：
8.cn201910643082.4公开了《一种罗汉果甜苷v的半合成方法》，是以11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v为原料，经催化加氢制得罗汉果甜苷v；
9.cn201910641262.9公开了《半合成罗汉果甜苷v的方法》，是以11
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o
‑
罗汉果甜苷v为原料，经硼氢化钠或硼氢化钾还原制得罗汉果甜苷v。
10.上述所有的化学半合成方法将中，葫芦烷型四环三萜皂苷11位碳原子上的羰基还原为羟基的过程中，都有发生α、β异构的风险。而且作为食品添加剂，最好能使用更为安全的合成方法。如果采用生物酶催化还原制备罗汉果苷v，则无类似的风险。
11.目前尚无文献公开报道将采用酶催化半合成罗汉果甜苷v的方法。


技术实现要素：

12.本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术不足，提供一种收率高、工艺简单、成本低廉、适宜于工业化生产的酶催化半合成罗汉果甜苷v的方法。
13.本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种酶催化半合成罗汉果甜苷v的方法，包括以下步骤：
14.(1)将含有11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v的底物和辅助底物投入缓冲溶液中，室温搅拌至全溶，得底物溶液；
15.(2)将羰基还原酶、葡萄糖脱氢酶和辅酶投入上述底物溶液中，保温搅拌；
16.(3)反应结束后调节ph值至碱性，过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱，上柱毕，水洗至流出液为中性，再用醇洗脱，将醇洗脱液浓缩、真空干燥，得罗汉果甜苷v。
17.采用酶催化法制备手性醇，产率高，立体选择型好，但酶的价格昂贵，若不能有效控制成本，则无法开展工业化的大规模生产。本发明采用酶法(葡萄糖脱氢酶)和非酶法(辅酶再生试剂)联合使用，使酶活性在整个反应过程保持较高的水平，最终产物产率高，降低了成本，提供了一种全新的以11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v为原料酶催化合成罗汉果甜苷v的方法。
18.优选的，步骤(1)底物中11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v的浓度为60
‑
150g/l，优选100
‑
120g/l。
19.优选的，步骤(1)中所述的辅助底物为葡萄糖，葡萄糖的用量为底物重量的0.2
‑
1倍，优选0.3
‑
0.5倍。
20.优选的，步骤(1)中所述的缓冲溶液为磷酸二氢钾
‑
氢氧化钠缓冲溶液，缓冲溶液的ph范围为5.8
‑
8.0，缓冲溶液的用量为底物重量的10
‑
20倍(l/g)。
21.优选的，步骤(2)中所述的羰基还原酶可以是来源于动物细胞、植物细胞或微生物，羰基还原酶的用量是底物重量的1
‑
5wt％，优选为2
‑
3wt％。
22.优选的，步骤(2)中所述的辅酶选自nadph或nadh，辅酶的用量是底物重量的0.5
‑
2wt％，优选1
‑
1.5wt％。
23.优选的，步骤(2)中所述的葡萄糖脱氢酶可以是来源于动物细胞、植物细胞或微生物，葡萄糖脱氢酶的用量是底物重量的0.1％
‑
1％，优选0.2
‑
0.3wt％。
24.若上述各种酶的用量过少，将导致反应液中酶的浓度过低，造成催化反应的速度变慢，生产效率低；若上述各种酶的用量过多，不但会造成浪费，还会增加后处理的难度。
25.优选的，步骤(2)中在反应第6
‑
10h开始持续补加辅酶再生试剂，或者在初始酶活力降低为60
‑
80％时持续补加辅酶再生试剂，在反应结束前2
‑
5h停止补加。辅酶再生试剂的加入量为底物重量的1
‑
10wt％，优选为3
‑
5wt％。所述辅酶再生试剂为吩嗪甲基硫酸盐/吩嗪乙基硫酸盐，连二亚硫酸钠和有机胺按照摩尔比2
‑
4:1
‑
2:1
‑
1.3的混合物。所述有机胺选自二乙胺，二丙胺，三甲胺，三乙胺，三丙胺中的至少一种。发明人预料不到地发现，以上述比例复配的辅酶再生试剂，能够弥补反应中后期酶活力不足的缺陷，稳定持续地使反应进行。最终罗汉果苷v的收率令人满意，达到了一个可工业化生产的程度。
26.优选的，步骤(2)中所述的保温反应的温度为25
‑
40℃。若反应的温度过低，将导致各种酶的催化效果降低，造成催化反应的速度变慢或反应不完全；若反应的温度过高，将导致各种酶变性、失活，同样不利于反应的进行。
27.优选的，步骤(2)中所述的搅拌的速度为40
‑
100rpm。若搅拌的速度过慢，将导致酶跟底物接触的几率降低，造成催化反应的速度变慢或反应不完全；若搅拌的速度过快，搅拌器过强的剪切力将破坏酶的空间结构，从而降低酶活，同样会造成催化反应的速度变慢或反应不完全。
28.优选的，步骤(2)中所述的反应时间为24
‑
48小时。
29.优选的，步骤(3)中所述的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液，所述的ph值为10
‑
12。将反应液用碱液调节ph值至碱性的目的，是终止反应并灭酶。
30.步骤(3)中，过滤的目的是除去已经失活、变性的各种酶，并防止大孔吸附树脂柱堵塞。
31.优选的，步骤(3)中所述的大孔吸附树脂为非极性，弱极性和中极性大孔吸附树脂，利用其能够吸附罗汉果甜苷v，而不吸附其他物质的特性型号包括但不局限于d101、ab
‑
8、lx
‑
t28、hp20。将反应液调碱、灭酶、过滤之后，通过大孔吸附树脂柱，是利用大孔树脂只会吸附滤液中的罗汉果甜苷v、而不会吸附滤液中其它成分(葡萄糖、葡萄糖酸和盐等)，从而达到分离纯化的目的。
32.本发明方法的合成反应式如下：
[0033][0034]
本发明方法的有益效果如下：
[0035]
(1)本方法提供了一种全新的高含量罗汉果甜苷v获得途径——酶催化半合成；同时也最大程度了提高了罗汉果甜苷v分离纯化之副产物，即11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v的附加值，丰富了罗汉果资源综合利用方式；
[0036]
(2)本发明采用了酶法辅酶再生，和外加试剂辅酶再生联用的方式，降低成本，按照本发明方法所得罗汉果甜苷v收率和纯度都高，满足了工业化生产要求；
[0037]
(3)本发明方法工艺简单，可操作性强，设备要求低，反应条件温和，生产成本低，不使用易燃易爆、有毒有害的化工溶剂，安全、绿色、环保，适宜于工业化生产。
具体实施方式
[0038]
下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
[0039]
本发明实施例所使用的11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v，纯度含量为97.5％(hplc)购于湖南华诚生物资源股份有限公司；所使用的大孔吸附树脂购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；所使用的羰基还原酶购于苏州汉酶生物技术有限公司，型号kred
‑
101；葡萄糖脱氢酶采购自湖北新德晟材料科技有限公司，比活性≥150u/mg。
[0040]
本发明实施例中，采用高效液相色谱外标法测定11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v及罗汉果甜苷v的含量。
[0041]
实施例1
[0042]
(1)底物溶液的配制：将底物(11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v，10g)和辅助底物葡萄糖3g投入100ml磷酸二氢钾
‑
氢氧化钠缓冲溶液(ph＝6.5)中，室温搅拌至全溶，得底物溶液；
[0043]
(2)酶催化：将0.2g羰基还原酶、0.1g葡萄糖脱氢酶和0.02gnadph投入上述底物溶液中，27℃保温，以60rpm的速度搅拌，反应6小时后持续补加辅酶再生试剂，至反应第25h停止补加，辅酶再生试剂为吩嗪甲基硫酸盐，连二亚硫酸钠和二乙胺按照摩尔比3.5：1.5：1的混合物，辅酶再生试剂加入量为0.3g，继续反应5h直至反应完全，得反应液；
[0044]
(3)后处理：反应毕，将反应液用氢氧化钾水溶液调节ph值至10，过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱(树脂型号：d101)，上柱毕，用纯水洗至大孔吸附树脂柱流出液为中性，再用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩、真空干燥，得9.12g罗汉果甜苷v。
[0045]
经高效液相色谱(hplc)外标法测定，本实施例所得罗汉果甜苷v的含量为96.3％，罗汉果甜苷v的收率为90.08％。
[0046]
实施例2
[0047]
(1)底物溶液的配制：将底物(11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v，12g)和辅助底物(葡萄糖5g)投入100ml磷酸二氢钾
‑
氢氧化钠缓冲溶液(ph＝7.0)中，室温搅拌至全溶，得底物溶液；
[0048]
(2)酶催化：将0.36g羰基还原酶、0.18g葡萄糖脱氢酶和0.03g nadph投入上述底物溶液中，35℃保温，以40rpm的速度搅拌，反应8小时后持续补加辅酶再生试剂，至反应第30h停止补加，辅酶再生试剂为吩嗪乙基硫酸盐，连二亚硫酸钠和三乙胺按照摩尔比3：1.3：1的混合物，辅酶再生试剂加入量为0.5g，继续反应5h直至反应完全，得反应液；
[0049]
(3)后处理：反应毕，将反应液用氢氧化钠水溶液调节ph值至11，过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱(树脂型号：ab
‑
8)，上柱毕，用纯水洗至大孔吸附树脂柱流出液为中性，再用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩、真空干燥，得11.25g罗汉果甜苷v。
[0050]
经高效液相色谱(hplc)外标法测定，本实施例所得罗汉果甜苷v的含量为97.1％，罗汉果甜苷v的收率为93.36％。
[0051]
实施例3
[0052]
(1)底物溶液的配制：将底物(11
‑
o
‑
罗汉果甜苷v，10g)和辅助底物(葡萄糖5g)投入100ml磷酸二氢钾
‑
氢氧化钠缓冲溶液(ph＝7.5)中，室温搅拌至全溶，得底物溶液；
[0053]
(2)酶催化：将0.5g羰基还原酶、0.2g葡萄糖脱氢酶和0.03gnadph投入上述底物溶液中，30℃保温，以80rpm的速度搅拌，反应8小时后持续补加辅酶再生试剂，至反应第30h停止补加，辅酶再生试剂为吩嗪乙基硫酸盐，连二亚硫酸钠和三乙胺按照摩尔比4：1.5：1的混合物，辅酶再生试剂加入量为0.5g，继续反应5h直至反应完全，得反应液；
[0054]
(3)后处理：反应毕，将反应液用氢氧化钾水溶液调节ph值至10，过滤，滤液通过大孔吸附树脂柱(树脂型号：lx
‑
t28)，上柱毕，用纯水洗至大孔吸附树脂柱流出液为中性，再用乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩、真空干燥，得9.82g罗汉果甜苷v。
[0055]
经高效液相色谱(hplc)外标法测定，本实施例所得罗汉果甜苷v的含量为95.2％，罗汉果甜苷v的收率为95.88％。
[0056]
实施例4
[0057]
其他条件和步骤和实施例1相同，区别在于步骤(2)中不补加辅酶再生试剂。最终得到7.41g罗汉果甜苷v，罗汉果甜苷v的含量为96.4％，收率为73.26％。
[0058]
实施例5
[0059]
其他条件和步骤和实施例1相同，区别在于步骤(2)中不补加辅酶再生试剂，并且葡萄糖脱氢酶的用量为0.5g。最终得到8.93g罗汉果甜苷v，罗汉果甜苷v的含量为95.8％，收率为87.74％。
[0060]
通过实施例1，4，5结果的比较，可以发现，通过补加辅酶再生试剂，可以减少葡萄糖脱氢酶的用量，提高收率，降低成本。