一株洋葱伯克霍尔德氏菌及其分离培养方法和应用与流程

1.本发明属于微生物种质资源的开发与利用领域，具体涉及一种洋葱伯克霍尔德氏菌及其分离培养方法和应用，更具体的说，涉及一株降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌及其降解能力的测定。


背景技术：

2.连作障碍是指连续在同一块土地上种植同种或近缘作物而造成作物生长情况异常、产量减少、品质降低、植株病虫害加重的现象，在烟草中普遍存在。自毒作用是指某些植物可以通过根系分泌、植株残茬等途径释放一些物质对同茬、下茬同种或同科植物的生长产生抑制作用的现象，是连作障碍发生的重要原因之一。酚酸类化合物是常见的自毒物质，可以被根际和土壤微生物迅速降解，导致微生物群落组成的变化(hanschen fs,winkelmann t.biofumigation for fighting replant disease
‑
areview[j].agronomy,2020,10(3):425.)。研究表明，酚酸类物质对烟草的生长有自毒作用，并随浓度升高而增强(程亚东，白羽祥，史普酉等.连作植烟土壤具有显著积累特征的两种酚酸的化感效应评价[j].核农学报，2020，34(10)：2307
‑
2315.)，且烟草土壤中自毒物质的含量会随连作年限的延长呈现增加趋势(孙敬国，王昌军，孙光伟等.连作年限对植烟根际土壤化感物质积累的影响——以湖北黄棕壤烟田为例[j].土壤，2021，53(1)：148
‑
153.)。连作土壤中自毒物质的积累是降解毒素的细菌丰度下降所致，对连作土壤接种毒素降解菌，可以有效降低自毒物质的含量，促进植株的生长，从而改善连作障碍问题(dong ll,xu j,li y,et al.manipulation of microbial community in the rhizosphere alleviates the replanting issues in panax ginseng[j].soil biology and biochemistry,2018,125:64
‑
74.)。
[0003]
对羟基苯甲酸作为烟草根系的自毒物质，是引发成烟草连作障碍的主要因素之一。有研究指出，外源添加对羟基苯甲酸后，烟草幼苗的生长受到较强的抑制作用，表现为侧根数量的减少，根系伸长的减缓，光合作用的降低，保护酶体系的破坏与钾的缺乏(吴文祥.烟草自毒物质及其对根际土壤微生物影响的研究[d].福建：福建农林大学，2010.)。因此，筛选具有降解自毒物质对羟基苯甲酸功能的菌株，并对其降解能力进行测定，可以为基于微生态调节的烟草连作障碍控制技术提供参考，为改善烟草土壤环境、有效提高烟草产量和品质提供科学依据。
[0004]
为了解决以上问题，提出本发明。


技术实现要素：

[0005]
本发明第一方面提供一株降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌。
[0006]
一株洋葱伯克霍尔德氏菌，编号为54
‑
s
‑
2，其微生物学分类命名为洋葱伯克霍尔德氏菌，拉丁文学名：burkholderia cepacia，已于2021年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmcc no.22766。中国微生物菌种保藏管理
委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。
[0007]
优选地，所述菌株的菌落特征为，在无机盐固体培养基上培养3
‑
5d后，单菌落圆形，边缘整齐，隆起，表面光滑湿润，呈浅黄色，菌落周围的平板透明。
[0008]
本发明第二方面提供一种分离和培养本发明第一方面提供所述的洋葱伯克霍尔德氏菌的方法，包括以下步骤：
[0009]
(1)将10g烟草土壤悬浮于含有100ml无菌水的锥形瓶中，28℃、180rpm振荡培养30min，以释放微生物，然后将其分装至灭菌的50ml离心管，在8000
×
g条件下离心10min，得到土壤悬浮液；
[0010]
(2)吸取5ml土壤悬浮液至含有45ml无机盐液体培养基的锥形瓶中，在28℃、180rpm条件下培养3天，得到培养物；所述无机盐液体培养基中还含有浓度为0.5mg/ml的对羟基苯甲酸，其作为唯一碳源加入；
[0011]
(3)将5ml培养物定量加入到无机盐液体培养基，继续培养两轮；
[0012]
(4)将步骤(3)培养后悬浮液用无菌水稀释106倍后均匀地涂布在无机盐固体培养基上，在28℃条件下培养3天，所述无机盐固体培养基中还含有浓度为0.5mg/ml的对羟基苯甲酸，其作为唯一碳源加入；
[0013]
将单个菌落连续划线3次以进一步纯化，将分离纯化获得的菌株命名为洋葱伯克霍尔德氏菌，用30％甘油在
‑
80℃超低温冰箱中长期保存菌株，备用。
[0014]
优选地，步骤(1)中，烟草土壤选自云南省玉溪市红塔区干海子村的烟草土壤，位置为24
°
16'37"n；102
°
32'34"e。
[0015]
优选地，步骤(2)中，所述无机盐液体培养基：nah2po
4 2800mg，(nh4)2so
4 500mg，ca(no3)2·
4(h2o)50mg，h3bo
3 0.03mg，feso4·
7h2o 0.2mg，mncl2·
4h2o 0.003mg，nicl2·
6h2o 0.002mg，kh2po
4 1000mg，mgcl
2 53mg，edta
‑
2na 0.5mg，cocl2·
6h2o 0.02mg，znso4·
7h2o 0.01mg，na2moo4·
2h2o 0.003mg，cucl2·
2h2o 0.001mg，蒸馏水1000ml，ph值7.0
±
0.2，经121℃灭菌30分钟备用；
[0016]
优选地，步骤(4)中，所述无机盐固体培养基：nah2po
4 2800mg，(nh4)2so
4 500mg，ca(no3)2·
4(h2o)50mg，h3bo
3 0.03mg，feso4·
7h2o 0.2mg，mncl2·
4h2o 0.003mg，nicl2·
6h2o 0.002mg，kh2po
4 1000mg，mgcl
2 53mg，edta
‑
2na 0.5mg，cocl2·
6h2o 0.02mg，znso4·
7h2o 0.01mg，na2moo4·
2h2o 0.003mg，cucl2·
2h2o 0.001mg，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph值7.0
±
0.2，经121℃灭菌30分钟备用；
[0017]
所述无机盐固体培养基中还含有浓度为0.5mg/ml的对羟基苯甲酸，其作为唯一碳源加入。
[0018]
所述无机盐液体培养基中还含有浓度为0.5mg/ml的对羟基苯甲酸，其作为唯一碳源加入。
[0019]
本发明的另一个目的是提供上述降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌54
‑
s
‑
2的新用途。本发明提供了上述洋降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌54
‑
s
‑
2在作为降解自毒物质对羟基苯甲酸微生物中的应用。
[0020]
具体的，本发明第三方面提供一种本发明第一方面所述的洋葱伯克霍尔德氏菌在作为降解对羟基苯甲酸微生物中的应用。
[0021]
优选地，所述的洋葱伯克霍尔德氏菌具有降解对羟基苯甲酸的功能，可以降低对羟基苯甲酸造成的烟草连作障碍。
[0022]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0023]
本发明从烟草土壤中分离纯化出一株具有自毒物质降解对羟基苯甲酸能力的细菌54
‑
s
‑
2，该菌株能以对羟基苯甲酸为唯一碳源生长，具有降解对羟基苯甲酸的能力。通过实验证明：本发明的菌株具有较强的降解自毒物质对羟基苯甲酸的特性，在解决自毒物质引起的连作障碍中具有潜在的应用前景。
附图说明
[0024]
图1为菌株54
‑
s
‑
2在无机盐固体培养基上的菌落形态。
[0025]
图2为16s rdna序列构建的菌株54
‑
s
‑
2系统发育树。
[0026]
图3为菌株54
‑
s
‑
2以对羟基苯甲酸为底物的生长曲线。
[0027]
图4为对羟基苯甲酸标准曲线。
[0028]
图5为菌株54
‑
s
‑
2以对羟基苯甲酸为底物的降解曲线。
[0029]
保藏说明
[0030]
菌种名称：洋葱伯克霍尔德氏菌
[0031]
拉丁名：burkholderia cepacia
[0032]
菌株编号：54
‑
s
‑2[0033]
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0034]
保藏机构简称：cgmcc
[0035]
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0036]
保藏日期：2021年6月23日
[0037]
保藏中心登记入册编号：cgmcc no.22766
具体实施方式
[0038]
下面结合具体实施例对本发明进行说明，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件以及手册中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例和对比例中所需要的原料均为市售。
[0039]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041]
下述实施例中的定量试验，均设置四次重复实验，结果取平均值。
[0042]
下述实施例中的培养基：
[0043]
(1)无机盐液体培养基：nah2po
4 2800mg，(nh4)2so
4 500mg，ca(no3)2·
4(h2o)50mg，h3bo
3 0.03mg，feso4·
7h2o 0.2mg，mncl2·
4h2o 0.003mg，nicl2·
6h2o 0.002mg，kh2po
4 1000mg，mgcl
2 53mg，edta
‑
2na 0.5mg，cocl2·
6h2o 0.02mg，znso4·
7h2o 0.01mg，na2moo4·
2h2o 0.003mg，cucl2·
2h2o 0.001mg，蒸馏水1000ml，ph值7.0
±
0.2，121℃灭菌30分钟备用。
[0044]
(2)无机盐固体培养基：nah2po
4 2800mg，(nh4)2so
4 500mg，ca(no3)2·
4(h2o)50mg，
h3bo
3 0.03mg，feso4·
7h2o 0.2mg，mncl2·
4h2o 0.003mg，nicl2·
6h2o 0.002mg，kh2po
4 1000mg，mgcl
2 53mg，edta
‑
2na 0.5mg，cocl2·
6h2o 0.02mg，znso4·
7h2o 0.01mg，na2moo4·
2h2o 0.003mg，cucl2·
2h2o 0.001mg，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph值7.0
±
0.2，121℃灭菌30分钟备用。
[0045]
上述无机盐培养基购自北京酷来搏科技有限公司。
[0046]
下述实施例中的试剂：
[0047]
对羟基苯甲酸分析纯99.5％购自上海麦克林生化科技有限公司。
[0048]
引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
)和1492r(5
’‑
cggttaccttgttacgactt
‑3’
)由生工生物工程(上海)股份有限公司有限公司合成。
[0049]
通用pcr mix购自诺唯赞生物科技有限公司。
[0050]
50
×
tae购自北京索莱宝科技有限公司。
[0051]
实施例1、一株降解自毒物质对羟基苯甲酸的细菌54
‑
s
‑
2的分离及鉴定
[0052]
一、菌株54
‑
s
‑
2的分离、纯化及保存
[0053]
将10g土壤(云南省玉溪市红塔区干海子村(24
°
16'37"n；102
°
32'34"e)烟草土壤)悬浮于含有100ml无菌水的锥形瓶中，28℃、180rpm振荡培养30min，以释放微生物。分装至灭菌的50ml离心管，在8000
×
g条件下离心10min。吸取5ml土壤悬浮液至含有45ml无机盐液体培养基(含有浓度为0.5mg/ml的对羟基苯甲酸，作为唯一碳源加入)的锥形瓶中，在28℃、180rpm条件下培养3d。同样，将5ml培养物定量加入到无机盐液体培养基(含有浓度为1mg/ml的对羟基苯甲酸)，继续培养两轮。最后，将菌株54
‑
s
‑
2悬浮液用无菌水稀释106倍后均匀地涂布在无机盐固体平板(含有浓度为1mg/ml的对羟基苯甲酸)上。在28℃条件下培养3d，将单个菌落连续划线3次以进一步纯化，将分离纯化获得的菌株为命名为54
‑
s
‑
2，用30％甘油在
‑
80℃超低温冰箱中长期保存菌株，备用。
[0054]
二、菌株54
‑
s
‑
2的鉴定
[0055]
1、菌株54
‑
s
‑
2的形态学鉴定
[0056]
将分离得到的菌株54
‑
s
‑
2通过划线法接种于无机盐固体培养基上，同时用无菌水稀释成菌悬液，用无菌水稀释106倍后均匀地涂布在无机盐固体平板(含有浓度为1mg/ml的对羟基苯甲酸)上。在25℃室温条件下培养3
‑
5d，培养至出现单菌落后观察其菌落大小、形状、颜色、透明度等形态。菌落形态如图1所示。
[0057]
结果显示，待测菌株54
‑
s
‑
2为革兰氏阴性菌，单菌落圆形，边缘整齐，隆起，表面光滑湿润，呈浅黄色，菌落周围的平板透明。
[0058]
2、菌株54
‑
s
‑
2的分子生物学鉴定
[0059]
采用热裂解法提取菌株54
‑
s
‑
2的dna，用灭菌牙签少量刮取单菌落并置于装有100μl ddh2o的灭菌离心管中，震荡混匀后100℃金属浴10min，室温条件下以最大转速离心2min，吸取上清转移至新的灭菌离心管，提取的dna即可使用或于
‑
20℃低温冰箱保存。使用细菌16s rdna通用引物27f/1492r扩增目的片段，pcr扩增反应体系共20μl：2
×
taq pcr mix 10μl，上、下游引物各0.5μl，模板1μl，ddh2o补足体积。反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环，72℃延长5min。
[0060]
反应结束后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，送往北京天一辉远生物科技有限公司进行双向测序。菌株54
‑
s
‑
2的细菌16s rdna基因序列如序列1所示，登陆ncbi(https://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，将测序结果进行blast分析。根据相关文献及ncbi数据库下载同源性序列，利用mega5.0软件，使用邻接法构建系统发育树明确其分类地位，选用ralstonia solanacearum为外群。系统发育树如图2所示。
[0061]
结果显示，burkholderia sp.经16s rdna基因完全可以将不同种分开，而菌株54
‑
s
‑
2与burkholderia cepacia(洋葱伯克霍尔德氏菌)(accession no.u96927)的亲缘关系最近，同源性达100％。
[0062]
综合上述形态学和分子生物学鉴定结果，将菌株54
‑
s
‑
2的分类命名为洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderia cepacia)。该菌株已于2021年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no.22766。
[0063]
实施例2、菌株54
‑
s
‑
2降解对羟基苯甲酸的能力测定
[0064]
一、菌株54
‑
s
‑
2以对羟基苯甲酸为唯一碳源的生长情况测定
[0065]
将菌株54
‑
s
‑
2从无机盐固体培养基上接种于含有浓度为1mg/ml的对羟基苯甲酸的无机盐液体培养基，在28℃摇床中180rpm培养24h，将菌株配制成菌悬液，使菌悬液浓度达到109cfu/ml。吸取2ml菌液至含有98ml无机盐液体培养基的锥形瓶中，培养基以对羟基苯甲酸作为唯一碳源，浓度为1mg/ml，在28℃、180rpm摇床中培养2d，以不加菌株54
‑
s
‑
2的无机盐液体培养基(含有浓度为1mg/ml的对羟基苯甲酸)作为对照，4次重复。液体培养期间，每隔4h取样，每次吸取2ml菌液暂存于离心管中，吸取1ml放到比色皿中在600nm波长下用分光光度计测定菌液的吸光值(od值)。以时间为横坐标，od值为纵坐标，绘制菌株54
‑
s
‑
2生长曲线。菌株54
‑
s
‑
2生长曲线如图3所示。另外1ml菌液放在4℃冰箱低温保存用于后续测定样品中对羟基苯甲酸的残留量。
[0066]
结果显示，菌株54
‑
s
‑
2在4h左右进入指数生长期，在12h左右生长量达到最大值，并且在16h后进入衰亡期，基本符合细菌的生长规律，说明菌株54
‑
s
‑
2可以利用对羟基苯甲酸作为唯一碳源生长。
[0067]
二、菌株54
‑
s
‑
2针对以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体无机盐培养基的降解作用
[0068]
1、对羟基苯甲酸标准曲线的绘制
[0069]
配制含有不同浓度对羟基苯甲酸的无机盐液体培养基(0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/ml)，置于无菌离心管中，放在4℃冰箱低温保存，取样完全后，与待测样品一起在250nm波长下用酶标仪测定不同对羟基苯甲酸浓度所对应的od值。以对羟基苯甲酸浓度为横坐标，od值为纵坐标，绘制对羟基苯甲酸标准曲线。不同浓度对羟基苯甲酸对应的250nm吸光值见表1。
[0070]
表1不同浓度对羟基苯甲酸对应的250nm吸光值
[0071][0072]
根据上述数值制作基苯甲酸标准曲线如图4所示。结果显示，对羟基苯甲酸标准曲
线公式为y＝41.957x+0.104，相关系数r2＝0.9984，其中x是对羟基苯甲酸浓度，y是此浓度下对应的od
250
值。
[0073]
2、对羟基苯甲酸降解曲线的测定
[0074]
取样结束后，将置于4℃低温保存的待测菌液吹吸并震荡均匀，吸取200μl于酶标板小孔中，在250nm波长下用酶标仪测定菌液中对羟基苯甲酸的od值，灭菌的ddh2o作为空白对照。以时间为横坐标，od值为纵坐标，绘制对羟基苯甲酸降解曲线。按照公式降解率(％)＝(初始对羟基苯甲酸浓度
‑
对羟基苯甲酸残留浓度)/初始对羟基苯甲酸浓度
×
100计算对羟基苯甲酸的降解率。不同取样时间对羟基苯甲酸的浓度及降解率见表2。
[0075]
表2不同取样时间对羟基苯甲酸的浓度及降解率
[0076][0077]
根据上述数值制作对羟基苯甲酸降解曲线如图5所示。结果显示，随着菌株54
‑
s
‑
2的生长，对羟基苯甲酸浓度呈现不断下降的趋势。对羟基苯甲酸浓度在菌株54
‑
s
‑
2进入指数生长期后开始急剧下降，对羟基苯甲酸的降解速度也随之增加，并且菌株54
‑
s
‑
2的生长量在16h达到最大值，对羟基苯甲酸的含量在此时也接近最低值，降解率达98.63％。说明分离得到菌株54
‑
s
‑
2具有较强的降解对羟基苯甲酸的能力。
[0078]
附序列表：
[0079]
洋葱伯克霍尔德氏菌，编号为54
‑
s
‑
2的16s rdna部分序列如下：
[0080]
ttaacatgca gtcgaacggc agcacgggtg cttgcacctg gtggcgagtg gcgaacgggt
[0081]
gagtaataca tcggaacatg tcctgtagtg ggggatagcc cggcgaaagc cggattaata
[0082]
ccgcatacga tctacggatg aaagcggggg accttcgggc ctcgcgctat agggttggcc
[0083]
gatggctgat tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc agtagctggt
[0084]
ctgagaggac gaccagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag
[0085]
cagtggggaa ttttggacaa tgggcgaaag cctgatccag caatgccgcg tgtgtgaaga
[0086]
aggccttcgg gttgtaaagc acttttgtcc ggaaagaaat ccttggttct aatatagccg
[0087]
ggggatgacg gtaccggaag aataagcacc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat
[0088]
acgtagggtg cgagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgtgcgcag gcggtttgct
[0089]
aagaccgatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc attggtgact ggcaggctag
[0090]
agtatggcag aggggggtag aattccacgt gtagcagtga aatgcgtaga gatgtggagg
[0091]
aataccgatg gcgaaggcag ccccctgggc caatactgac gctcatgcac gaaagcgtgg
[0092]
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgcccta aacgatgtca actagttgtt
[0093]
ggggattcat ttccttagta acgtagctaa cgcgtgaagt tgaccgcctg gggagtacgg
[0094]
tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg atgatgtgga
[0095]
ttaattcgat gcaacgcgaa aaaccttacc tacccttgac atggtcggaa tcctgctgag
[0096]
aggtgggagt gctcgaaaga gaaccgatac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt
[0097]
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctta gttgctacgc
[0098]
aagagcactc taaggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt
[0099]
cctcatggcc cttatgggta gggcttcaca cgtcatacaa tggtcggaac agagggttgc
[0100]
caacccgcga gggggagcta atcccagaaa accgatcgta gtccggattg cactctgcaa
[0101]
ctcgagtgca tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg
[0102]
ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttttac cagaagtggc
[0103]
tagtctaacc gcaaggagga cgtcaccacg gtagatg