一种Patern

一种patern
ò‑
b
ü
chi优化的反应方法
技术领域
1.本发明涉及patern
ò‑
b
ü
chi反应领域，尤其涉及一种patern
ò‑
b
ü
chi优化的反应方法。


背景技术：

2.脂质是构成细胞膜的重要成分，主要负责储存能量，控制细胞生物学复杂的信号通路；现代研究表明脂质在非酒精性脂肪性肝病(nafld)、神经疾病和癌症的发病机制中具有重要作用；脂质包含饱和脂质和不饱和脂质，由于不饱和脂质中碳碳双键(c＝c)位置的不同，不饱和脂类有多个同分异构体，且具有不同的生理意义；因此对脂质的准确认识至关重要；已经有研究者成功地使用了一种紫外线照射的光化学反应，即patern
ò‑
b
ü
chi(pb)反应，结合串联质谱(ms/ms)鉴定和量化复杂混合物中的不饱和脂质；但是依旧存在很大的挑战，首先pb反应的加成率较低，pb试剂的选择较少；pb反应是羰基化合物与烯烃的一种经典的[2+2]光化学反应，生成包含一个氧杂环丁烷的化合物，可用来合成一些通过加热或其它化学方法难以得到的氧杂环丁烷；pb反应机理以及热不稳定性，将含有羰基的醛或酮，在uv激发下与烯烃中的c＝c键发生反应，由于羰基和c＝c键的相对位置，形成两个氧杂环丁烷的同分异构体，因此如何能够提高pb反应的加成率成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

[0003]
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种patern
ò‑
b
ü
chi优化的反应方法.
[0004]
本发明是通过以下技术方案予以实现：一种patern
ò‑
b
ü
chi优化的反应方法，反应条件为2份反应试剂加入20份pb试剂，溶于20份以14:6比例混合的乙腈与水的混合溶剂中，平行光反应器的照射灯是254nm，以25％、50％、75％或100％的照射功率照射混合溶剂30min。
[0005]
根据上述技术方案，优选地，反应试剂是苯甲醛、甲醛、乙醛、2
‑
吡啶甲醛、3
‑
甲醛吡啶、4
‑
吡啶甲醛、丙酮、3
‑
乙酰吡啶、3
‑
乙酰吡咯中一种或多种的混合物。
[0006]
根据上述技术方案，优选地，所述pb试剂是3
‑
甲醛吡啶。
[0007]
根据上述技术方案，优选地，平行光反应器的照射灯是254nm，以100％的照射功率照射反应溶剂30min。
[0008]
根据上述技术方案，优选地，平行光反应器的参数设置为搅拌50，旋转90，旋转速度100％。
[0009]
本发明的有益效果是：本发明采用平行光反应仪进行pb反应，并采用质谱mrm模式进行检测；对pb反应试剂进行筛选，得到最佳pb反应试剂3
‑
甲醛吡啶，反应迅速且得到反应结合因子最大；本发明将pb反应与质谱检测分离，互不干扰，使pb反应尽可能完整，质谱检测也能达到最佳条件；综上所述，pb反应联合ms/ms可以作为脂质生物学中筛选不饱和脂质
的有力工具；本发明采用最佳pb试剂，将平行光反应装置与质谱mrm模型相结合，可以拓宽pb反应在脂质组学中脂质异构体鉴定和定量研究的领域的应用，极大提高pb反应效率。
附图说明
[0010]
图1示出了表示不同pb试剂产生的加法因子x的直方图；
[0011]
图2示出了将2mm油酸添加到20mm 3
‑
甲醛吡啶中，溶于20ml异丙醇和水(14：6)的混合溶剂中，并在254nm紫外线下照射10min，30min，60min总离子色谱图(tic)；
[0012]
图3示出了将2mm油酸添加到20mm丙酮中，溶于20ml异丙醇和水(14：6)的混合溶剂中，并在254nm紫外线下照射10min，30min，60min总离子色谱图(tic)；
[0013]
图4示出了由3
‑
乙酰吡啶与3
‑
甲醛吡啶作为pb试剂产生的加成因子x的直方图；
[0014]
图5示出的直方图表示随着照射时间的增加不同溶剂对pb反应的影响；
[0015]
图6示出的直方图表示不同溶剂对pb反应的影响；
[0016]
图7示出的直方图表示不同光照强度对pb反应的影响。
具体实施方式
[0017]
下面将结合附图对发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于发明保护的范围。
[0018]
如图所示，本发明提供了一种patern
ò‑
b
ü
chi优化的反应方法，按照体积份数比，反应条件为2份反应试剂加入20份pb试剂，溶于20份以14:6比例混合的乙腈与水的混合溶剂中，平行光反应器的照射灯是254nm，以25％、50％、75％或100％的照射功率照射混合溶剂30min。
[0019]
根据上述实施例，优选地，反应试剂是苯甲醛、甲醛、乙醛、2
‑
吡啶甲醛、3
‑
甲醛吡啶、4
‑
吡啶甲醛、丙酮、3
‑
乙酰吡啶、3
‑
乙酰吡咯中一种或多种的混合物。
[0020]
根据上述实施例，优选地，所述pb试剂是3
‑
甲醛吡啶。
[0021]
根据上述实施例，优选地，平行光反应器的照射灯是254nm，以100％的照射功率照射反应溶剂30min。
[0022]
根据上述实施例，优选地，平行光反应器的参数设置为搅拌50，旋转90，旋转速度100％。
[0023]
uhplc
‑
ms仪器条件:uhplc分析采用日本岛津lc
‑
30ad系统(日本京都岛津)；采用acquity uplc c18色谱柱(waters,1.7μm,2.1
×
100mm2)进行分离；流动相为水:甲醇:乙腈(3:1:1,v/v/v)(a)和乙腈(b)；a和b均含有5mmol/l的醋酸铵；流速为0.3ml/min，进样量为2μl；梯度洗脱:0～0.5min,20％b；0.5～1.5min,20～40％b；1.5～3min,40～60％b；3
‑
13分钟，60
‑
100％b；13
‑
14分钟，100％b；14～17分钟，20％；质谱是在配备esi源的三重四极线离子阱质谱仪(qtrap 6500+)(ab sciex,framingham,ma,usa)上进行的；色谱是在预定的多反应监测(mrm)中获得的，有一定的时间窗；在正离子或负离子模式下；ms参数设置如：gas temperature,400℃；ion spray voltage,5500v；gs1and gs2,both 50psi；cur,35psi。
[0024]
mrm采集方式:根据pb结合实验推测碰撞诱导得到的母离子和子离子；以3
‑
甲醛吡啶为例，3
‑
甲醛吡啶与油酸的质核比分别为107.04、282.26。在正离子模式下，油酸与k离子
结合，质量与原子核的比值为321.22；油酸与3
‑
甲醛吡啶在光辐射条件下发生pb反应，生成了两个pb反应结合物，互为同分异构体，正离子模式下，pb反应结合物的分子质量为389.29；根据对pb反应的理解和对其反应结合物的观察，我们可以推断两种pb反应结合物会在质谱的碰撞诱导下产生两个分子质量为218.19和248.16的子离子，并可以通过mrm模式对其进行靶向的定性与定量。
[0025]
平行光反射器条件:用于pb反应的平行光反应器(pl
‑
dy1600)由北京普林赛思科技有限公司制造；参数设置为搅拌50，旋转90，旋转速度100％。照射灯为254nm，照射功率分别为25％、50％、70％或100％。
[0026]
ms数据处理：所有原始数据均使用analyst 1.6.2软件进行分析；峰面积推导采用sciex os1.4软件(ab sciex,framingham,ma,usa)；使用prism 8.0(graph pad prism)进行统计分析；以加成因子x作为评价指标；计算公式为x＝(i(pb
on
‑
pb
off
))/i(reference(oa))。
[0027]
pb试剂的选用
[0028]
一个适当的pb试剂首先能与不饱和脂质迅速发生pb反应，其次其pb加合物应该能容易检测到，有较高的加成因子，以便更好地定位不饱和脂质的双键位置。考虑第一个要素，本试验考察了化学性质较为活泼的苯甲醛、甲醛、乙醛、丙酮、2
‑
乙酰吡啶、3
‑
乙酰吡咯、2
‑
甲醛吡啶、3
‑
甲醛吡啶、4
‑
吡啶甲醛。试验结果发现丙酮、苯甲醛、甲醛、乙醛在负离子模式下诊断离子的响应较好；而苯环上带有n的pb试剂如3
‑
乙酰吡咯、3
‑
甲醛吡啶得到的诊断离子在正离子模式下响应较好，以丙酮与3
‑
甲醛吡啶为例，其pb反应及诊断离子如下所示，本试验以油酸为标准不饱和脂质试剂；油酸的m/z为282.26da，负离子模式下m/z为281.25da，正离子模式下m/z为321.22da成为k的加和离子，丙酮的m/z为58.04da，3
‑
甲醛吡啶的m/z为107.04da。油酸与丙酮的pb反应加合物在负离子模式下得到两个m/z为339.29da的同分异构体(t
‑
1，t
‑
2)，在碰撞能的作用下得到两个诊断离子，其m/z分别为197.15da(t
‑
1)、171.10da(t
‑
2)。油酸与3
‑
甲醛吡啶的pb反应加合物在正离子模式下得到两个m/z为390.30da的同分异构体(f
‑
1，f
‑
2)，在碰撞能的作用下得到两个诊断离子，其m/z分别为218.19da(f
‑
1)、248.16da(f
‑
2)。根据诊断离子可计算出不饱和脂质的双键位置，其中由mrm的质谱图可以看到诊断离子f
‑
1m/z218.19 da出现了两个峰，猜测其保留时间靠前的为诊断离子f
‑
2在碰撞能量的作用下丢失羧基，而形成m/z 218.19da。考察了所有我们选择的pb试剂，首先根据加成因子得到，3
‑
甲醛吡啶的加成因子较大，本实验也考察了同样条件下，随着uv照射时间的增加，当pb试剂为3
‑
甲醛吡啶时，pb反应结合物的质谱响应有明显的加强，而pb试剂为丙酮时，则无明显变化。同时，我们也将3
‑
甲醛吡啶与pb加成率较高的3
‑
乙酰吡啶进行比较，观察得到10s内，3
‑
甲醛吡啶的pb加成因子明显优于3
‑
乙酰吡啶，证明3
‑
甲醛吡啶的pb反应的非常迅速，不仅可以运用在离线的pb反应中，也可以更好的将pb反应与液相质谱在线联用。因此选择3
‑
甲醛吡啶作为pb试剂开始进行优化其反应条件，并进一步考察其反应速度。
[0029]
优化pb溶剂条件：分别将异丙醇与乙腈作为pb反应的溶剂考察溶剂对pb反应的影响；同时可考察了pb试剂为丙酮时溶剂对pb反应的影响。
[0030]3‑
甲醛吡啶由其结构可知苯环上结合了n元素，我们也知道脂肪酸有羧基基团，溶剂中若有羟基可能对pb试剂与不饱和脂质的pb反应有抑制作用，所以我们考察了溶剂异丙
醇与乙腈，观察两种溶剂中pb试剂及油酸pb反应的变化；我们比较了pb试剂为ac与3
‑
甲醛吡啶时，在两种溶剂的pb反应结合物的响应，pb试剂为ac时，不论溶剂为乙腈还是异丙醇，pb反应结合物的响应都没有明显的变化，而pb试剂为3
‑
甲醛吡啶，溶剂为乙腈时，pb反应结合物的响应明显高于溶剂为异丙醇时的响应，当溶剂为乙腈时，油酸的响应随着时间的增加逐渐降低，而溶剂为异丙醇时，其响应无明显变化，进一步说明pb反应在溶剂为乙腈的体系里反应较强烈；因此，优先选择乙腈作为pb反应溶剂。
[0031]
优化紫外照射功率：考察平行光反应仪器中25％、50％、75％、100％光照功率；为考察不同照射强度对pb反应的影响，考察了平行光反应仪中四个照射功率，分别为25％、50％、75％、100％，254nm紫外照射功率为100％时，pb反应加成因子x达到最高；本研究最终选择照射功率为100％。
[0032]
优化pb反应条件：利用软件设计响应面实验，考察pb反应中脂质样品与pb试剂的比例，反应溶剂与水的比例，紫外照射时间对pb反应的影响，优化pb反应条件，并得到其检测限、定量限。
[0033]
为进一步提高pb加成反应因子，根据筛选出的pb试剂与反应溶剂，我们利用设计软件，设计了响应面试验，考察pb加成反应中脂质样品与pb试剂的反应比例(a)，反应溶剂的的占比(b)，254nm紫外照射时间(c)对pb反应加成因子的影响，结果显示试验拟合方程具有显著性；由试验结果得到pb试剂的比例、反应溶剂的占比越大，254nm紫外照射时间越长，得到pb反应加成因子越大；响应面优化结果得到最优pb反应条件为：1mm油酸与10mm 3
‑
甲醛吡啶溶于溶剂为18mlacn和2ml水中，254nm100％的照射功率，照射时间120分钟。并以此优化条件验证三次；结果表明pb加成因子x达到4，大大的提升了pb反应结合物的质谱响应；在优化条件的基础上，得到其检测限(s/n＝3)为10pm和定量限(s/n＝10)为100pm。
[0034]3‑
甲醛吡啶对不饱和脂质双键位置的精确定位
[0035]
首先，在正离子模式下，因为3
‑
甲醛吡啶中含有n，诊断离子的m/z值是偶数，因此其pb反应结合物很容易被识别。
[0036]
其次，pb反应会生成两个同分异构体，其分子为(c
a
h
b
o
c
+3
‑
甲醛吡啶+h)，通过碰撞诱导解离，生成两个诊断离子f1和f2(含有羧基)，f1＝14n1+92,f2＝14n2+92+30，且n1+n2＝a,(n1是不饱和的双键位置脂质)。
[0037]
以油酸(n＝9)作为一个例子，3
‑
甲醛吡啶为pb试剂，3
‑
甲醛吡啶中含有羰基醛，在uv激发下与烯烃中的c＝c键发生反应，油酸的双键裂开与3
‑
甲醛吡啶结合生成了pb反应结合物，在正离子模式下，得到两个m/z值为390.3da的同分异构体，通过碰撞诱导解离，pb反应结合物会在双键结合的位置断开，得到有诊断离子片段f1、f2；f1＝218.19＝14n1+92，f2＝248.16＝14n2+92+30，计算可得，n1＝9，所以油酸的双键位置是在位置9。
[0038]
脂类是人体各种器官和组织中的重要物质，在人体各种生命活动中发挥着重要作用，其中包括大量的不饱和脂类；由于双键位置的不同，不饱和脂类具有大量的异构体；结构决定功能，准确识别不饱和脂质的双键位置是十分重要的；本发明采用平行光反应仪进行pb反应，并采用质谱mrm模式进行检测；对pb反应试剂进行筛选，得到最佳pb反应试剂3
‑
甲醛吡啶，反应迅速且得到反应结合因子最大；本发明将pb反应与质谱检测分离，互不干扰，使pb反应尽可能完整，质谱检测也能达到最佳条件；综上所述，pb反应联合ms/ms可以作为脂质生物学中筛选不饱和脂质的有力工具；本发明采用最佳pb试剂，将平行光反应装置
与质谱mrm模型相结合，可以拓宽pb反应在脂质组学中脂质异构体鉴定和定量研究的领域的应用，极大提高pb反应效率。
[0039]
在发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0040]
在发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在发明中的具体含义。
[0041]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离发明各实施例技术方案的范围。