一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法

一种利用核仁素增强mrna稳定表达的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用核仁素增强mrna稳定表达的方法。


背景技术：

2.核仁素是一种rna结合蛋白，包含四个rna结合区域，该区域提供特定的rna结合位点,它们通过识别特殊的rna结合域与核酸相互作用，广泛参与到rna剪切、转运、序列编辑、胞内定位及翻译控制等多个过程。由于新冠疫情爆发，极大推动了mrna技术在生物制药领域的应用，也让mrna一跃成为研究的热点。mrna疫苗比传统疫苗具有许多优势：与某些病毒疫苗不同，mrna不会整合到基因组中，从而避免了插入突变的风险，mrna疫苗可以以无细胞的方式制造，从而实现快速、经济、高效的生产。此外，单个mrna疫苗可以编码多种抗原，增强针对适应性病原体的免疫反应，并能够以单一配方针对多种微生物或病毒变体。截止目前，全球累计mrna药物及疫苗研发管线超过150种，主要针对传染病、肿瘤疾病、蛋白质替代与基因治疗。除mrna新冠疫苗紧急上市外，其他大多处于早期阶段。研究表明，mrna稳定性的调节在调节基因表达中起着重要作用，调节mrna稳定性的许多元素位于mrna的3’端非翻译区域即3’utr，3'utr位mrna的c末端，utr茎环结构中存在与mrna结合蛋白的结合位点，调控mrna稳定性、亚细胞定位并能与调节蛋白质相互作用，更好地发挥其调控功能。而如何获得在体内保持稳定的mrna成为当前亟待研究的重要课题。


技术实现要素：

3.本发明旨在着力解决现有mrna在转录后易降解无法稳定表达蛋白的技术问题，本发明的目的是提供了一种利用核仁素增强mrna稳定性表达的方法。
4.本发明目的是通过以下方式实现：
5.本方法通过dna序列的设计，通过体外转录出带有核仁素和功能蛋白的mrna，使用脂质体包裹后制得脂质纳米粒，导入细胞表达核仁素和功能蛋白，核仁素作为一种反式作用因子结合rna的3’utr，从而提高功能蛋白mrna的稳定性，达到增强荧功能蛋白的表达量的效果。
6.一种利用核仁素增强mrna稳定表达的方法，主要包括如下步骤：
7.(1)合成依次为t7启动子序列、5’utr序列、优化后的核仁素序列、连接元件p2a序列、功能蛋白序列和3’utr序列的目的基因序列，连接到质粒载体中，构建含有目的基因的质粒；
8.(2)设计引物，将步骤(1)得到的质粒通过pcr反应获得目的基因尾部添加了polyt序列的线性目的基因片段；
9.(3)以步骤(2)得到的线性目的基因片段为模板，转录获得mrna；
10.(4)通过加帽酶系统对步骤(3)得到的mrna进行加帽反应，获得5’端携带cap1帽子结构的mrna；
11.(5)将步骤(4)得到的携带cap1帽子结构的mrna和脂质体以特定比例混合，获得脂
质纳米粒；
12.(6)将步骤(5)得到的脂质纳米粒转染细胞中，增强细胞中mrna的稳定表达。
13.进一步地，步骤(1)中的所述质粒载体为puc57
‑
kan。
14.进一步地，步骤(1)中t7启动子序列如seq id no：1所示，5’utr序列如seq id no：2所示，优化后的核仁素序列如seq id no：3所示，连接元件p2a序列如seq id no：4所示，功能蛋白序列如seq id no：5所示，3’utr序列如seq id no：6所示。
15.进一步地，步骤(2)中正向引物的核苷酸序列如seq id no：7所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no：8所示，pcr反应试剂包括beyofusion
tm
pcr master mix预混液。
16.进一步地，步骤(2)中pcr反应体系中质粒浓度为0.1
‑
10ng/μl。
17.进一步地，步骤(2)中所述线性目的基因片段通过磁珠纯化法获得。
18.进一步地，步骤(3)中所述转录的具体过程为：将线性目的基因片段、rna转录酶、缓冲液、核苷三磷酸在室温下混合，于37℃条件下孵育3h。
19.进一步地，步骤(3)中转录完成后，加入dnaseⅰ，37℃孵育15min，以去除dna模板。
20.进一步地，步骤(4)中所述的加帽酶系统为牛痘病毒加帽酶系统。
21.进一步地，步骤(5)中mrna和脂质体的体积比为(1:1)～(1:5)，脂质体中阳离子脂质体、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇的摩尔比为50：10：37.5：2.5，所述阳离子脂质体为4
‑
(n,n
‑
二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯，辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱。
22.进一步地，步骤(6)中所述细胞为人宫颈癌细胞。
23.本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
24.1.本发明所合成的mrna均由体外进行转录进行加帽反应获得，细胞内存在许多rna酶，它们可从5’端攻击游离的rna，使mrna极易降解，当mrna的5’端加上m7gpppg帽子后，可阻止rna酶的切割，延长mrna的半衰期，提高翻译效率，同时真核生物mrna必需通过5’帽结合蛋白才能接触核糖体从而正确起始翻译。
25.2.本方法在mrna翻译过程中设计添加了核仁素，核仁素是一种rna结合蛋白，在mrna翻译的过程中作为反式作用因子，核仁素由四个结构域组成，其中核仁素的前两个rna结合域顺式排列结合特定的核仁素识别原件，从而提高mrna的稳定性，实现更加有效的翻译过程。
26.3.本实验编码区所采用的蛋白质序列均进行了优化，由于密码子使用偏好在不同物种甚至某一物种内的不同基因都具有特异性，同样的蛋白质可以从不同的基因序列中产生，有些组合会导致更高的蛋白质产量；对蛋白质的密码子进行优化，最佳密码子组合可以降低mrna的降解，从而拥有高表达量的蛋白。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
28.图1为实施例1设计的dna序列的结构图。
29.图2为实施例1中磁珠法纯化得到的高纯dna的电泳图谱，第一孔道为marker，高亮条带为1k和3k，其余孔道均为pcr纯化后的上样条带。
30.图3为表达核仁素的mrna和未表达核仁素的mrna表达的荧光素酶量的对比图。
具体实施方式
31.下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
32.实施例1
33.本发明以易检测蛋白表达量的荧光素酶为例，在荧光素酶前表达核仁素，与未在荧光素酶前表达核仁素的序列作对比，说明核仁素结合荧光素酶的3’utr从而增强蛋白的表达量，具体步骤如下：
34.1.设计dna序列：以puc57
‑
kan为质粒载体，选择bamhi和ecori为目的基因两侧的酶切位点，目的基因序列依次为t7启动子序列、5’utr序列、优化后的核仁素序列、连接元件p2a序列、优化后的荧光素酶序列、3’utr序列，dna模板序列不同元件的信息如表1所示，序列的结构图如图1所示，具体的核苷酸序列如seq id no：9所示。
35.表1.dna模板序列不同元件的信息
[0036][0037]
2.进行质粒pcr反应加尾：按照试剂盒说明书冰上配置pcr反应体系。将质粒冻干粉溶解于400ul的ddh2o中，配制成0.01ug/ul(10ng/ul)浓度的质粒溶液，取10um的引物溶液于冰上融化。其中所述正向引物：ctatgcggcatcagagcaga，反向引物序列为tttt
…
(120)aggagaagtctgccgttactg。
[0038]
表2.pcr反应体系
[0039][0040]
加入组分后，用手指轻弹pcr管数次，使反应体系混合均匀，室温下低速离心数秒，使液体体积积聚于管底。
[0041]
表3.pcr反应参数
[0042][0043]
3.核酸纯化：采用磁珠法纯化pcr产物，得到高质量的纯化dna片段。利用超微量紫外分光光度计对dna进行定性和定量分析，进行琼脂糖凝胶电泳验证dna模板的完整性及纯度。电泳图谱如图2所示。
[0044]
4.体外转录：根据体外转录试剂盒，在含有rna转录酶、缓冲液、核苷三磷酸等条件的体外无细胞系统中，以dna为模板转录得mrna。操作如下：冰上融化表4中的各组分，室温下混合，反应体系置于37℃金属浴中孵育3h。转录完成后每0.5ug模板dna加入1μl dnaseⅰ，37℃孵育15min，以去除dna模板。
[0045]
表4.体外转录体系(20μl)
[0046]
[0047][0048]
注：先混匀其他组分，最后加入t7 rna polymerase mix，轻轻混匀。
[0049]
5.磁珠法纯化体外转录产物：以mrna转录产物与磁珠质量比为1:1，将转录产物和磁珠充分混匀后，弃去缓冲液，加入相应体积的rna结合缓冲液，终体积缓冲液稀释为1
×
，使磁珠充分吸附于磁力架上，置于磁力架上干燥，尽量弃去上清，减少残留溶液，得到目的基因转录相应的mrna。
[0050]
6.5’端标记反应：采用牛痘病毒加帽酶系统对转录的rna进行加帽反应，使相应的rna在5’端携带cap1帽子结构，具体过程如下：
[0051]
(1)用rnase
‑
free water将50μg rna稀释至67ul。
[0052]
(2)将所得的rna溶液置于65℃加热10min，结束后冰上放置5min。
[0053]
(3)依次加入表5中的各组分。
[0054]
(4)37℃反应30min。
[0055]
表5.加帽反应系统中的组分
[0056][0057]
7.脂质体的配制：按照以下配比配制脂质体，其中阳离子脂质体：辅助脂质：胆固醇：聚乙二醇的摩尔比为50：10：37.5：2.5，所述阳离子脂质体为4
‑
(n,n
‑
二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯，缩写为dlin
‑
mc3
‑
dma，辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱，缩写为dspc。
[0058]
8.制备脂质纳米粒：根据脂质体和mrna的体积比为3：1，配置所需体积的纳米粒，轻微震荡混匀，制得转染细胞所需的脂质纳米粒。
[0059]
9.转染前一天将人宫颈癌细胞铺板，观察细胞状态，使细胞密度生长铺板大约为70％
‑
90％后，方可转染脂质纳米粒到人宫颈癌细胞，加入脂质纳米粒后轻微震荡混匀，于37℃、5％co2的饱和湿度培养箱中，培养24～48小时。
[0060]
10.将培养板平衡至室温后，加入荧光素底物，使细胞充分裂解3分钟后，在酶标仪
检测发光信号。其结果图为图3所示。
[0061]
由图3对比可知，在用酶标仪检测发光值的过程中，表达核仁素的mrna比未表达核仁素的mrna产生更高的信号值，信号值的高低即代表mrna翻译的蛋白质的量，间接说明表达核仁素的mrna具有更高的稳定性。
[0062]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。