一株赖氨酸芽孢杆菌及其在降解塑化剂中的应用

1.本发明涉及一株赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)及其在降解邻苯二甲酸酯类塑化剂中的应用，即针对叶菜及其种植土壤中塑化剂残留污染，利用该赖氨酸芽孢杆菌制备菌剂并加以应用方法，属于微生物学与食品安全领域。
技术背景
2.邻苯二甲酸酯(paes)是一类重要的合成有机物，常广泛用作增塑剂，以增强塑料的柔韧性和机械强度，还用于玩具、粘合剂、化妆品、医疗器材、建筑材料、农药载体等。paes在塑料制品中含量可达到10％
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60％。paes的广泛使用导致其在各种环境介质中都有残留，如水、空气、土壤、植物、食品等。一些paes是内分泌干扰物(edc)，对动物和人类具有潜在的致癌、致畸和致突变作用。其中邻苯二甲酸二甲酯(dmp)、邻苯二甲酸二丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二乙酯(di
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ethyl phthalate，dep)、邻苯二甲酸二丁基苄基酯(bbp)、邻苯二甲酸二(2
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乙基己基)酯(dehp)和邻苯二甲酸二辛酯(dop)被美国国家环保局列为优先控制污染物。
3.据报道，dbp和dehp是中国农业土壤中主要的paes，浓度比英国和丹麦的同类型土壤中高。土壤中的dbp和dehp容易被蔬菜吸收和富集，进而可以通过食物链对人类健康构成潜在风险。目前，针对土壤中塑化剂修复的方法主要有化学氧化、微生物植物联合修复、微生物修复。化学氧化修复对土壤具有破坏性，不适用于农田土壤；微生物植物联合修复能高效的修复塑化剂，但是会影响正常的农业生产；而微生物降解的环境适应性仍是需要解决的关键问题。目前赖氨酸芽孢杆菌在降解塑化剂中的应用尚未见报道。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本技术提供一株赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)，该菌株可促进paes降解，对土壤
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蔬菜体系中paes进行修复，减少塑化剂从土壤向蔬菜中的迁移和富集，同时清除土壤和蔬菜体内塑化剂，具有方便、高效和不影响农业生产，同时不引入其他污染，保证蔬菜的安全生产。
5.具体而言，本技术是通过如下技术方案实现的：
6.一株保藏号为cgmcc no:21835的赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)，申请人将其自命名为y4，该菌株分离自构树树叶，菌株呈棒杆状，能产芽孢，芽孢杆菌属，对动植物无害。申请人于2021年2月25日将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
7.其次，本技术还提供了上述保藏号为cgmcc no:21835的赖氨酸芽孢杆菌在降解环境中邻苯二甲酸酯(paes)的应用；上述环境包括土壤、水体、空气等空间；上述邻苯二甲酸酯优选dbp、dehp、dmp、dep、dibp、dnop中的至少一种。
8.第三，本技术提供了上述保藏号为cgmcc no:21835的赖氨酸芽孢杆菌在降解植物体内邻苯二甲酸酯的应用；所述植物包括叶菜类等蔬菜(如上海青等)；所述邻苯二甲酸酯
优选dbp、dehp、dmp、dep、dibp、dnop中的至少一种。具体而言，其具体应用方式如下：将od
600
＝0.3(菌浓度约为108cfu/ml)赖氨酸芽孢杆菌菌剂对上海青进行浸根12h处理，用以降解上海青植株中残留的邻苯二甲酸酯。
9.第四，本技术还提供了利用保藏号为cgmcc no:21835的赖氨酸芽孢杆菌降解土壤中邻苯二甲酸酯的方法，将od
600
＝0.3(菌浓度约为108cfu/ml)赖氨酸芽孢杆菌菌剂喷洒受邻苯二甲酸酯污染的土壤，用以促进土壤中邻苯二甲酸酯(优选dbp和dehp)的降解，菌剂喷施量约为土壤重量的1％。
10.第五，本技术提供了含有保藏号为cgmcc no:21835的赖氨酸芽孢杆菌的菌剂。
11.本技术首次发现保藏号为cgmcc no:21835的赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)对邻苯二甲酸酯的降解特性，并进一步利用该菌株制备为菌剂，用以降解土壤及蔬菜中邻苯二甲酸酯(如dbp/dehp)的降解，利用生物方法减少塑化剂从土壤向蔬菜中的迁移和富集，保证蔬菜的安全生产，不引入其他污染源，绿色环保。
附图说明
12.图1为赖氨酸芽孢杆菌y4电镜照片。
13.图2为赖氨酸芽孢杆菌y4对邻苯二甲酸酯的降解功能验证结果示意图。
14.图3为微生物菌剂y4对土壤中残留dbp修复结果示意图。
15.图4为微生物菌剂y4对土壤中残留dehp修复结果示意图。
16.图5为该微生物菌剂对减少叶菜体内塑化剂污染实验结果示意图。
具体实施方式
17.实施例所涉及的培养基：
18.lb培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母膏，10g/l氯化钠，ph 7.0；
19.无机盐液体培养基msm：mgso4·
7h2o(0.4g)，feso4·
7h2o(0.2g)，k2hpo4(0.2g)，(nh4)2so4(0.2g)和caso4(0.08g)去离子水1l，ph 7.0～7.2；
20.种子培养基：k2hpo4(4.8g)，kh2po4(3.5g)，(nh4)2so4(2g)，mgcl2(0.16g)，cacl2(0.02g)，namoo4.2h2o(0.0024g)，fecl3(0.0018g)，mncl2.2h2o(0.0015g)，ph＝7.0，加水至1l。
21.无机盐固体培养基：无机盐液体培养基中添加20g/l琼脂；
22.以下实施例所涉及的试剂，除非特别说明，均为商业渠道购买。
23.实施例1赖氨酸芽孢杆菌y4的分离鉴定与降解功能验证
24.1、菌株lysinibacillussp.sp.y4分离鉴定
25.申请人于2016年7月采集来自江苏省农业科学院实验大田(e118
°
86
′
,n32
°
03
′
)中的构树树叶，然后对树叶进行表面消毒，研磨成汁液，涂布在含有dbp/dehp为唯一碳氮源的无机盐固体培养基上，筛选获得一株具备dbp与dehp降解特性的植物内生菌lysinibacillus sp.y4。
26.申请人将该菌自命名为y4，其电镜图片如图1所示，该菌株呈直杆状，具圆端或方端。
27.通过生理生化特性和16srdna保守序列比对y4菌株鉴定为赖氨酸芽孢杆菌
(lysinibacillus sp.)，于2021年2月25日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。保藏编号为cgmcc no:21835,分类命名为赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sp.)。
28.2、lysinibacillus sp.y4菌株降解dbp功能验证
29.先用lb培养基过夜培养步骤1筛选获得的纯y4菌株，菌体经过离心(5000rpm，5min)并用灭菌msm洗涤三遍，然后用msm重悬成y4菌悬液(od
600
＝1.0)。将y4菌悬液分别加入20μg/ml、10μg/ml以dbp和dehp(混合)为碳氮源的无机盐液体培养基中培养0.5、1、2、4、5、7天；最后用气相色谱串联质谱法(gc
‑
ms)检测无机盐液体培养基中的dbp/dehp残留含量，对比不接菌的对照，计算y4菌株的降解率：
30.dbp/dehp降解率＝(对照组含量
‑
实验组含量)/对照组含量*100％；最终确定lysinibacillus sp.y4的dbp降解性能。气相色谱串联质谱(gc
‑
ms)参见国标《gb 31604.30
‑
2016》。
31.结果如图2，od＝1.0的y4菌液对20μg/mldbp与dehp降解率分别为18.7％，26.5％；对10μg/mldbp与dehp降解率分别为16.7％，31.4％。lysinibacillus sp.y4对邻苯二甲酸酯具有降解能力。
32.实施例2 dbp菌剂的制备
33.所述y4菌剂是这样获得的：
34.a)将实施例1或的赖氨酸芽孢菌y4接种至lb培养基，30℃划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落于lb培养基中，30℃，180rpm摇床震荡培养24h，获得活化菌种；
35.b)取活菌体培养物50ml于4℃、5000rpm下离心5min,取沉淀菌体用无菌生理盐水冲洗3次，再用无菌生理盐水调节至菌浓度为108cfu/ml,即获得y4菌剂。
36.实施例3 y4菌剂修复土壤paes污染实验
37.土壤为风干南京水稻土壤，土壤ph 6.67。玻璃盆中加入1kg过筛细土，玻璃烧杯中加入100ml丙酮溶解dbp/dehp原药(20mg/kg)，倒入土中用玻璃棒搅拌均匀，置于通风橱待丙酮挥发12h。再按质量比5％的添加量向实验土壤中加入实施例2获得的y4菌剂稀释液(菌浓度约为108cfu/ml)，调节土壤含水量为30％(在实际土壤paes污染修复中，维持土壤正常含水率即可)。实验设置葡萄糖组，对照组，y4组，葡萄糖+y4，豆粕+y4组。额外碳源添加按土重1％添加。将玻璃容器置于暗室，老化5天后使用。定期取样用gc
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ms法测定土壤paes含量，确定该土壤修复剂的修复效果。
38.实验结果如图3和图4所示，相比空白组污染土壤，加入y4后dehp的降解效率在10天后提升了32％。通过添加外加碳源，如y4+葡萄糖组，相比仅加入葡萄糖组，dbp与dehp降解率分别提升57％和27％，而在添加有机质豆粕后获得显著更高的降解效果。
39.实施例4 y4菌剂定殖上海青修复paes污染实验
40.将三叶一心的上海青根全部浸泡在实施例2获得的y4菌剂稀释液od
600
＝0.3(菌浓度约为108cfu/ml)中12h，对照组浸泡在生理盐水中。然后移栽至添加了dbp和dehp的土壤中(南京水稻土，浓度20mg/kg)。
41.栽培一周后取叶菜可食用部分冻干，用气相色谱质谱联用(gc
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ms)检测叶菜的dbp/dehp含量。该实验结果如图5所示，相比ck，dbp降低40％，dehp降低39％，说明该菌剂能
够显著降低叶菜可食用部分dbp/dehp含量。