用于检测霍乱弧菌O1群和O139群的组合物、试剂盒和检测方法与流程

用于检测霍乱弧菌o1群和o139群的组合物、试剂盒和检测方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及用于检测霍乱弧菌o1群和o139群的组合物、试剂盒和检测方法。


背景技术：

2.霍乱(cholera)是一个古老的烈性肠道传染病，被称为“摧毁地球最可怕的瘟疫之一”。其临床表现为急性腹泻、呕吐，泻吐频繁、量大，为米泔水样，从而导致脱水、电解质紊乱及周围循环衰竭，严重者可致休克、酸中毒，如不及时抢救，病死率甚高。轻症患者有时类似肠炎，易于漏诊或误诊，其危害性同样不可忽视。革兰氏阴性菌
‑
霍乱弧菌(vibrio cholerae，vc)是引起霍乱的病原菌。
3.霍乱弧菌在分类上为弧菌科弧菌属。根据菌体(o)抗原不同，可将霍乱弧菌分成若干o血清群。目前已分出200个以上的o血清群(o serogroups)，但仅发现o1群和o139群霍乱弧菌能引发霍乱，对于o1群和o139群以外的血清群被统称为非o1/o139群。
4.由于霍乱通常来势迅猛，通过水源可迅速传播等特点，易引起世界大流行，被确定为国际检疫传染病。我国在传染病防治法中规定霍乱属于甲类传染病，必须重点监测和检疫。因此，需要建立一种能应用于现场甚至野外的霍乱弧菌致病血清群(o1群和o139群)的核酸检测方法，这对于病原检出和提高疫情应对能力具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测霍乱弧菌o1群和o139群的组合物、试剂盒和检测方法。所述检测方法的特异性好，灵敏度高，还具有简便、快速和实用的特点，能够满足现场和野外环境下对于霍乱弧菌的检测需要。
6.本发明提供了一种用于检测霍乱弧菌o1群和o139群的组合物，包括：
7.用于检测霍乱弧菌o1群的引物对1，其核苷酸序列为：
8.正向引物：5
’‑
cattcacttatgttgcctcggt
‑3’
(seq id no：1)，
9.反向引物：5
’‑
gactcaccttcgatttcagca
‑3’
(seq id no：2)；
10.以及，用于检测霍乱弧菌o139群的引物对2，其核苷酸序列为：
11.正向引物：5
’‑
gttcccttgttagaccaccg
‑3’
(seq id no：3)，
12.反向引物：5
’‑
cctttccacctcggtatttca
‑3’
(seq id no：4)。
13.采用上述用于检测霍乱弧菌o1群和o139群的组合物对待测物进行检测，可实现对霍乱弧菌o1群和霍乱弧菌o139群的同时检测，以区别其致病的具体霍乱弧菌血清群。
14.优选的，所述组合物还包括：
15.用于检测霍乱弧菌o1群的探针a，其核苷酸序列为：5
’‑
aataccatagtccagtgtg
‑3’
(seq id no：5)；
16.以及，用于检测霍乱弧菌o139群的探针b，其核苷酸序列为：5
’‑
tgctgagtttgctgccagtt
‑3’
(seq id no：6)。
17.更优选的，所述探针a和所述探针b的5’端均标记有荧光基团，所述探针a和所述探针b的3’端均标记有淬灭基团；且所述探针a和所述探针b所标记的荧光基团不相同。
18.其中，所述荧光基团包括但不限于以下类型：fam、cy5、texas red、tet、hex；所述淬灭基团包括但不限于以下类型：bhq1、bhq2、tamra、eclipse、mgb。
19.进一步优选的，所述探针a所标记的荧光基团为fam，所述探针b所标记的荧光基团为hex。所述探针a和探针b所标记的淬灭基团均为mgb。
20.本发明还提供了一种用于检测霍乱弧菌o1群和o139群的试剂盒，包括上述的组合物。
21.优选的，所述试剂盒还包括四种核苷酸、阳性质控物、阴性质控物、镁离子缓冲液、甲酰胺、硫酸铵、海藻糖和taq dna聚合酶，所述四种核苷酸为datp、dgtp、dctp和dutp。
22.更优选的，所述阴性质控物为te缓冲液或超纯水。所述te缓冲液由tris和edta配置而成，配置用水为无核糖核酸酶的超纯水。
23.更优选的，所述阳性质控物为含有如seq id no：7所示核苷酸序列的pgem
‑
t载体质粒。所述如seq id no:7所示核苷酸序列中包括霍乱弧菌o1群和o139群的特异性保守序列。
24.tgtaccaacattcacttatgttgcctcggttaataccatagtccagtgtggtgcgttacccgtttttgctgaaatcgaaggtgagtctctacaagtgagcttcattagaagggcgggttcccttgttagaccaccgcattgctgagtttgctgccagtttgccgatccatttgaaataccgaggtggaaagggaaagtgg(seq id no.7)。
25.本发明还提供了一种霍乱弧菌o1群和o139群的检测方法，包括以下步骤：
26.提取待测样品的dna，采用上述试剂盒对所述dna进行检测。
27.具体的，提取待测样品的dna，在热对流pcr管中加入所述dna，采用上述试剂盒和热对流pcr检测设备进行检测。
28.本发明采用恒温热隔绝式pcr(iipcr)的方法对霍乱弧菌进行检测，恒温热隔绝式pcr(insulated isothermal pcr，iipcr)亦称为热对流pcr，是由krishnan m等人于2002年建立的一种新型简易pcr扩增技术发展起来。iipcr利用了溶液的热对流原理，即当针对装有液体的容器底部加热时，由于上方表面较冷的液体比重较高，因此会因为重力向下移动；下方受热的液体则因为比重较低，因此会被挤到向上移动，因此会自然形成液体的循环。当较热的液体流动至表面时，又会因为环境的散热而变冷，较冷的液体流动至底部时又会因为受热而变热，所以这种循环可以一直持续下去，从而形成了稳定的温度梯度。如果对受热容器的形状和材质进行特殊设计，找到最适的管径与高度，如市场上的下细上粗的“r
‑
tube”pcr管，能巧妙的控制对流的时间与散热的速率，就可以形成适合pcr的变性
‑
退火
‑
延伸等反应的局部环境。
29.优选的，在所述热对流pcr管中，每条引物的终浓度均为0.3
‑
0.8μmol/l，每条探针的终浓度均为0.2
‑
0.4μmol/l。
30.优选的，所述检测方法的反应程序为：50℃保温8
‑
10min；95℃热对流pcr反应45
‑
50min。
31.优选的，所述热对流pcr检测设备为pockit
tm
现场核酸检测设备(台湾瑞基海洋生
物科技股份有限公司)。在反应结束后，pockit设备可自动将荧光信号变化的信噪比(s/n)按内置算法和默认的s/n阈值转化为阳性、阴性或有疑问这3类结果，分别以“+”、
“‑”
和“？”的形式显示于仪器的触控屏幕。“+”表示结果为阳性，
“‑”
表示结果为阴性，“？”表示结果不明确，需重新检测。
32.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
33.(1)本发明所设计的特异性引物和探针可置于同一个pcr体系内，能够实现同时对霍乱弧菌o1群和o139群的检测和区分，且特异性和灵敏度良好；
34.(2)本发明采用热对流pcr方法对霍乱弧菌进行检测，具有操作简便、实用、低成本的优势，且检测仪器易于携带，适合现场甚至野外快速检测；且检测过程中无需再开盖加样，能有效防止样品受到污染；
35.(3)本发明所述的检测方法用时较短，上机检测50
‑
60min即可得出检测结果。
附图说明
36.图1为特异性试验中非o1/o139群霍乱弧菌的检测结果；
37.图2为特异性试验中o1群霍乱弧菌的检测结果；
38.图3为特异性试验中o139群霍乱弧菌的检测结果。
具体实施方式
39.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
40.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
41.实施例1
42.本实施例提供一种用于检测霍乱弧菌o1群和o139群的组合物，包括：
43.用于检测霍乱弧菌o1群的引物对1，其核苷酸序列为：
44.正向引物：5
’‑
cattcacttatgttgcctcggt
‑3’
(seq id no：1)，
45.反向引物：5
’‑
gactcaccttcgatttcagca
‑3’
(seq id no：2)；
46.用于检测霍乱弧菌o139群的引物对2，其核苷酸序列为：
47.正向引物：5
’‑
gttcccttgttagaccaccg
‑3’
(seq id no：3)，
48.反向引物：5
’‑
cctttccacctcggtatttca
‑3’
(seq id no：4)；
49.用于检测霍乱弧菌o1群的探针a，其核苷酸序列为：5
’‑
aataccatagtccagtgtg
‑3’
(seq id no：5)；
50.用于检测霍乱弧菌o139群的探针b，其核苷酸序列为：5
’‑
tgctgagtttgctgccagtt
‑3’
(seq id no：6)。
51.其中用于检测霍乱弧菌o1群的探针a的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有淬灭基团mgb。用于检测霍乱弧菌o139群的探针b的5’端标记有荧光基团hex，3’端标记有淬灭基团mgb。
52.实施例2
53.本实施例提供一种用于检测霍乱弧菌o1群和o139群的试剂盒，包括实施例1中的组合物(包含有引物对1、引物对2、探针a和探针b)，还包括四种核苷酸datp、dgtp、dctp和dutp、阳性质控物、阴性质控物、镁离子缓冲液、甲酰胺、硫酸铵、海藻糖和taq dna聚合酶。
54.其中阴性质控物为te缓冲液，te缓冲液由tris和edta配置而成，配置用水为无核糖核酸酶的超纯水。
55.其中阳性质控物为含有如seq id no：7所示核苷酸序列的pgem
‑
t载体质粒。
56.tgtaccaacattcacttatgttgcctcggttaataccatagtccagtgtggtgcgttacccgtttttgctgaaatcgaaggtgagtctctacaagtgagcttcattagaagggcgggttcccttgttagaccaccgcattgctgagtttgctgccagtttgccgatccatttgaaataccgaggtggaaagggaaagtgg(seq id no.7)。
57.实施例3
58.本实施例提供一种霍乱弧菌o1群和o139群的检测方法，包括以下步骤：
59.提取待测样品的dna，在热对流专用pcr管(r
‑
tube)中加入5μl所提取的dna、2.5μl taq dna聚合酶、17.5μl的超纯水，得到25μl的反应混合液。该反应混合液中还包括有四种核苷酸datp、dgtp、dctp和dutp，实施例1中的组合物(包含有引物对1、引物对2、探针a和探针b)，以及镁离子缓冲液、甲酰胺、硫酸铵和海藻糖。每一条引物的终浓度为0.6μmol/l，探针的终浓度0.3μmol/l。
60.盖好r
‑
tube反应管的密封帽，于专配的离心机中短暂离心后置于pockit
tm
核酸分析仪(台湾瑞基海洋生物科技股份有限公司)中进行检测。
61.iipcr检测的反应程序为：
62.选择“520nm和550nm”的双波长模式，检测时长为仪器中系统默认的58min。内建程序设置为：首先执行50℃保温10min，然后95℃热对流pcr反应约48min。通过仪器显示得出霍乱弧菌o1群和o139群的检测结果，其中520nm波长显示为霍乱弧菌o1群的检测结果、550nm波长显示为霍乱弧菌o139群的检测结果。
63.实施例4
64.特异性检测
65.试验1：
66.该试验选择与霍乱弧菌具有相似感染症状的常见病原体的核酸样本作为特异性试验的参考品，细菌类型包括：非o1/o139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、大肠杆菌o157。
67.将上述病毒样品与实施例2试剂盒中的阳性质控物和阴性质控物作为试验的检测样品，阳性质控物作为阳性对照，阴性质控物作为阴性对照，采用实施例3中的检测方法进行检测。
68.检测结果如图1所示：1
‑
8号分别对应非o1/o139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、大肠杆菌o157、阳性对照、阴性对照在520nm和550nm波长下的检测结果。
69.实验结果显示1
‑
6号各参考品细菌的检测结果均报告为阴性，即
“‑”
；阴性对照的检测结果报告为阴性，即
“‑”
；阳性对照的检测结果报告为阳性，即“+”。以上结果表明本发明所用检测方法具备良好的特异性，哪怕是非o1/o139群霍乱弧菌的样品也不会检测为假
阳性。
70.试验2：
71.该试验选择与霍乱弧菌具有相似感染症状的常见病原体的核酸样本作为特异性试验的参考品，细菌类型包括：o1群霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、大肠杆菌o157。
72.将上述病毒样品与实施例2试剂盒中的阳性质控物和阴性质控物作为试验的检测样品，阳性质控物作为阳性对照，阴性质控物作为阴性对照，采用实施例3中的检测方法进行检测。
73.检测结果如图1所示：1
‑
8号分别对应o1群霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、大肠杆菌o157、阳性对照、阴性对照在520nm和550nm波长下的检测结果。
74.实验结果显示1号o1群霍乱弧菌的检测结果为阳性，即“+”；2
‑
6号样品细菌的检测结果均报告为阴性，即
“‑”
；阴性对照的检测结果报告为阴性，即
“‑”
；阳性对照的检测结果报告为阳性，即“+”。以上结果表明本发明所用检测方法具备良好的特异性，可以对o1群霍乱弧菌实现准确检出。
75.试验3：
76.该试验选择与霍乱弧菌具有相似感染症状的常见病原体的核酸样本作为特异性试验的参考品，细菌类型包括：o139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、大肠杆菌o157。
77.将上述病毒样品与实施例2试剂盒中的阳性质控物和阴性质控物作为试验的检测样品，阳性质控物作为阳性对照，阴性质控物作为阴性对照，采用实施例3中的检测方法进行检测。
78.检测结果如图1所示：1
‑
8号分别对应o139群霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、大肠杆菌o157、阳性对照、阴性对照在520nm和550nm波长下的检测结果。
79.实验结果显示1号o139群霍乱弧菌的检测结果为阳性，即“+”；2
‑
6号样品细菌的检测结果均报告为阴性，即
“‑”
；阴性对照的检测结果报告为阴性，即
“‑”
；阳性对照的检测结果报告为阳性，即“+”。以上结果表明本发明所用检测方法具备良好的特异性，可以对o139群霍乱弧菌实现准确检出。
80.实施例5
81.灵敏度试验
82.对实施例2中的阳性质控物(质粒)以10倍梯度进行稀释，得到拷贝数为107、106、105、104、103、102、101和100的阳性质粒，通过实施例3中的检测方法对上述质粒样品进行检测，每组3次重复试验，结果表明能有效检出的最低拷贝数为102的阳性质粒。
83.实施例6
84.重复性试验
85.采用实施例5中拷贝数为105和103的阳性质粒，每组重复检测10次，pockit
tm
设备的报告结果均为阳性，即“+”，表明本发明所使用的iipcr检测方法具备良好的重复性与稳定性。
86.上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作
出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。