一种庚二酸的全生物合成方法

1.本发明涉及一种庚二酸的全生物合成方法，属于生物工程领域。


背景技术：

2.庚二酸(pimelic acid，heptanedioic acid)，又名蒲桃酸，1,5－戊烷二羧酸，是一种七碳二元羧酸，广泛用于合成润滑油、增塑剂、共聚物、表面活性剂等，是化工行业中重要的化学原料和中间体。
3.目前工业上生产庚二酸主要依赖于化学方法。通过异戊醇还原，并用钠裂解水杨酸，结晶出庚二酸，收率为43
‑
50％。庚二酸的实验室制备方法还包括以冠醚作为相转移催化剂催化1,5
‑
戊二醇、三溴化磷、氰化钾合成庚二酸。这些方法工艺繁多，反应时间长，不利于大规模推广。
4.为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成庚二酸的道路上。目前报道的庚二酸的生物合成途径主要有两种途径：一种是大肠杆菌体内的bioc
‑
bioh途径，bioc(转甲基酶)可甲基化丙二酰
‑
酰基载体蛋白(acp)生成丙二酰甲酯，降低分子极性，从而允许脂肪酸合成酶对后者进行延伸，生成庚二酸衍生物——庚二酰
‑
acp甲酯；bioh可以水解庚二酰acp甲酯的末端甲基，恢复极性羧基，阻止脂肪酸合成酶进一步延伸，进而产生庚二酸。另一种则是枯草芽孢杆菌的bioi
‑
biow途径，有研究指出枯草芽孢杆菌生物素操纵子中bioi
‑
orf2
‑
orf3基因序列与庚二酸的合成密切相关，将强麦芽糖启动子p
glv
连接到bioi
‑
orf2
‑
orf3顺反子上游，整合到枯草芽孢杆菌染色体上，最终可以有效增加庚二酸的产量。上述的两种途径都产生了微量的庚二酸，但对于其合成机理并未进一步阐明。
5.自然界中存在着天然的二元羧酸合成/分解代谢途径，其中褐色喜热裂孢菌的3
‑
氧代己二酰辅酶a途径可以高效的利用己二酸，在大肠杆菌中重构该途径，可以利用乙酰
‑
coa和琥珀酰
‑
coa为底物使己二酸的产量达到68.0g
·
l
‑1(目前报导的最高值)。同样地，该途径还可利用乙酰
‑
coa和丙二酰
‑
coa合成戊二酸，产量达到4.8g
·
l
‑1。究其原因，该途径中的β
‑
酮硫解酶(tfu_0875)底物谱较宽，可同时催化多种酰基
‑
coa生成不同的二元羧酸。因此，利用代谢网络极强的可塑性，通过天然代谢途径和合成途径的结合，我们可以以己二酸逆降解途径为基础，设计以低廉、可再生的原料(葡萄糖等)到庚二酸的生物合成新路线，为庚二酸在微生物体内的合成提供新思路。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明提供了一种产庚二酸的重组大肠杆菌，分模块过量表达了来自褐色喜热裂孢菌的β
‑
酮硫解酶(tfu_0875)、3
‑
羟酰基
‑
辅酶a脱氢酶(tfu_2399)、3
‑
羟基己二酰脱氢酶(tfu_0067)、5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶a还原酶(tfu_1647)和己二酰辅酶a合成酶的基因(tfu_2576，tfu_2577)，并敲除了基因ldha、atob、sucd，实现了将戊二酸高效转化为庚二酸，显著提升了庚二酸的产量。
7.本发明提供了一种全细胞生产庚二酸的方法，所述方法是利用基因工程菌发酵生
产庚二酸；所述基因工程菌敲除了乳酸脱氢酶基因、乙酰
‑
coa乙酰基转移酶基因及琥珀酰
‑
coa合成酶α亚基基因，并分模块过表达编码来自褐色喜热裂孢菌的β
‑
酮硫解酶(tfu_0875)、3
‑
羟酰基
‑
辅酶a脱氢酶(tfu_2399)、3
‑
羟基己二酰脱氢酶(tfu_0067)、5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶a还原酶(tfu_1647)和己二酰辅酶a合成酶的基因(tfu_2576，tfu_2577，即tfu_2576
‑
7)。
8.在一种实施方式中，所述β
‑
酮硫解酶(tfu_0875)的ncbi登录号为mh157180；所述3
‑
羟酰基
‑
辅酶a脱氢酶(tfu_2399)的ncbi登录号为mh157181；所述3
‑
羟基己二酰脱氢酶(tfu_0067)的ncbi登录号为mh157182；所述5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶a还原酶(tfu_1647)的ncbi登录号为mh157183；所述己二酰辅酶a合成酶的基因(tfu_2576，tfu_2577，即tfu_2576
‑
7)的ncbi登录号为mh157194。
9.在一种实施方式中，利用质粒prsfduet
‑
1表达所述β
‑
酮硫解酶和3
‑
羟酰基
‑
辅酶a脱氢酶。
10.在一种实施方式中，利用质粒ptrc99a表达所述3
‑
羟基己二酰脱氢酶和5
‑
羧基
‑2‑
戊烯酰辅酶a还原酶。
11.在一种实施方式中，利用质粒pcdfduet
‑
1表达所述己二酰辅酶a合成酶。
12.在一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主。
13.在一种实施方式中，以大肠杆菌bl21(de3)为宿主。
14.在一种实施方式中，将所述基因工程菌在35～37℃培养12
‑
16小时得到菌液，将菌液按1～5％的体积比接种至至发酵培养基，于35～37℃培养至od
600
为0.6
‑
0.8时加入终浓度为1～5mm的iptg并降温至25～30℃诱导培养72小时。
15.在一种实施方式中，发酵培养基为sob培养基，所述sob培养基中含有3～5g
·
l
‑1酵母粉，15～20g
·
l
‑1胰蛋白胨，1～5g
·
l
‑1nacl，2～3g
·
l
‑1mgcl2·
6h2o，0.1～0.2g
·
l
‑1kcl，1～4g
·
l
‑1葡萄糖，10～50μg
·
ml
‑1硫酸卡那霉素，10～50μg
·
ml
‑1氨苄青霉素，10～50μg
·
ml
‑1链霉素。
16.在一种实施方式中，所述sob培养基中含有6～7g
·
l
‑1戊二酸及10～50mm kh2po4。
17.优选的，kh2po4浓度为20～50mm或30～50mm。
18.优选的，kh2po4浓度为20mm、30mm或50mm。
19.本发明还提供一种构建所述基因工程菌的方法，包括以下步骤：
20.(1)以质粒prsfduet
‑
1为骨架载体，连接基因片段tfu_0875、tfu_2399，得到重组质粒pad
‑
1；
21.(2)以质粒ptrc99a为骨架载体，连接基因片段tfu_0067、tfu_1647，得到重组质粒pad
‑
4；
22.(3)以质粒pcdfduet
‑
1为骨架载体，连接基因片段tfu_2576、tfu_2577，得到重组质粒pad
‑
6；
23.(4)将质粒pad
‑
1、pad
‑
4、pad
‑
6转入敲除了ldha、atob、sucd基因的大肠杆菌bl21(de3)，得到重组大肠杆菌abd
‑
3。
24.在一种实施方式中，步骤(1)利用ecorⅰ和hindⅲ双酶切处理质粒prsfduet
‑
1及基因片段tfu_0875，通过t4dna连接酶连接得到重组质粒prsf
‑
0875；利用bglⅱ和kpnⅰ双酶切处理重组质粒prsf
‑
0875及基因片段tfu_2399，经t4dna连接酶连接，得到了连接基因片段
tfu_0875、tfu_2399的重组质粒pad
‑
1。
25.在一种实施方式中，步骤(2)利用ncoⅰ和hindⅲ双酶切处理质粒ptrc99a及基因片段tfu_0067、tfu_1647，通过t4dna连接酶连接得到重组质粒pad
‑
4。
26.在一种实施方式中，步骤(3)利用ncoⅰ和hindⅲ双酶切处理质粒pcdfduet
‑
1及基因片段tfu_2576、tfu_2577，通过t4dna连接酶连接得到重组质粒pad
‑
6。
27.本发明提供了所述方法在生产庚二酸、庚二酸衍生物及含有庚二酸的产品中的应用。
28.本发明的有益效果：本发明以己二酸逆降解途径为基础，在大肠杆菌中经过5个反应利用戊二酸合成庚二酸，相较于传统的合成步骤较短，反应机理较为清晰，可为后续的研究提供保障。同时，优化了生物法合成庚二酸的工艺，在发酵过程中添加kh2po4，显著提升了庚二酸的产量，使得产量可达252.60mg
·
l
‑1，不仅可以为庚二酸的工业生产提供新思路，对于其衍生物的开发也具有重要作用。
附图说明
29.图1为庚二酸合成途径。
30.图2为bl21(de3)敲除乳酸脱氢酶基因(ldha)、乙酰
‑
coa乙酰基转移酶基因(atob)及琥珀酰
‑
coa合成酶α亚基基因(sucd)的菌落pcr验证图谱；nc
‑
1：bl21
△
ldha阴性对照(1742bp)，1：bl21
△
ldha(752bp)；nc
‑
2：bl21
△
atob阴性对照(1939bp)，2：bl21
△
atob(754bp)；nc
‑
3：bl21
△
sucd阴性对照(1623bp)，3：bl21
△
sucd(753bp)；m：2000marker。
31.图3为质粒pad
‑
1、pad
‑
4、pad
‑
6质粒图谱。
32.图4为重组大肠杆菌abd
‑
3菌落pcr验证图谱；1：质粒pad
‑
1(3142bp)，2：质粒pad
‑
4(2699bp)，3：质粒pad
‑
6(2642bp)，m：5000marker。
33.图5为在sob培养基；1mm iptg时所有含有pad
‑
1、pad
‑
4、pad
‑
6质粒的重组大肠杆菌的庚二酸产量图谱；
“‑”
表示该菌株中对应基因被敲除。
34.图6为庚二酸液相质谱检测特征离子碎片图谱。
35.图7为重组大肠杆菌abd
‑
3在不同浓度不同无机盐下的庚二酸产量图谱。
36.图8为重组大肠杆菌abd
‑
3在不同kh2po4浓度下的庚二酸产量图谱。
37.图9为利用己二酸逆降解途径合成己二酸及戊二酸相关机理。
具体实施方式
38.表1下述实施例涉及的引物序列表
[0039][0040][0041]
备注：
“”
标注序列为同源序列
[0042]
实施例1：bl21(de3)中乳酸脱氢酶基因(ldha)、乙酰
‑
coa乙酰基转移酶基因(atob)及琥珀酰
‑
coa合成酶α亚基基因(sucd)的敲除
[0043]
ldha的基因号为ecd_01352，atob的基因号为ecd_02151，sucd的基因号为ecd_00688。
[0044]
利用crispr/cas9技术，根据kegg网站上公布的目的基因的核苷酸序列设计引物，敲除ldha基因，敲除所需的ptarget质粒由苏州泓讯公司设计提供。
[0045]
上下游同源臂片段的获得：以ldhaup500
‑
f、ldhaup500
‑
r和ldhadown500
‑
f、ldhadown500
‑
r为两对引物，以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板，通过pcr反应分别扩增出大小为515bp的dna片段，该片段分别与ldha基因的上游和下游的515bp为同源序列，对扩增的dna片段进行凝胶回收纯化，通过融合pcr将纯化的上下游片段连接成大小为1000bp的同源臂片段并进行胶回收纯化。
[0046]
ldha基因的敲除：以大肠杆菌bl21(de3)作为待敲菌株，制备电转感受态。首先将pcas质粒导入感受态中，挑取转化子pcr验证，将阳性转化子接种lb培养基中继续制备电转感受态细胞(lb培养基中加入终浓度为20mm的阿拉伯糖诱导蛋白表达)。将ptarget质粒及同源臂片段以1:4的摩尔比转入感受态中，挑取转化子pcr验证，以yzldha
‑
f和yzldha
‑
r为引物，选取具有单一条带且大小为752bp的单菌落，即为正确的敲除株(对照为1742bp)。
[0047]
敲除菌株ptarget质粒及pcas质粒的消除：将敲除成功的菌株接种于lb培养基中30℃培养，同时加iptg进行诱导，随后将浑浊的菌液接种于含有壮观霉素的lb培养基中培养，若菌株在壮观霉素中不生长则说明ptarget质粒已消除；将已消除ptarget质粒的菌株接种于lb培养基中37℃培养，随后将浑浊的菌液接种于含有硫酸卡那霉素的lb培养基中培养，若菌株不生长，则说明pcas质粒已消除，将已消除质粒的菌株命名为bl21
△
ldha。
[0048]
其他基因采用相同的方法进行敲除，最终得到了7株敲除菌株，分别是：
[0049]
3株单独敲除ldha基因、atob基因、sucd基因的大肠杆菌：bl21
△
ldha(命名为a)、bl21
△
atob(命名为b)及bl21
△
sucd(命名为d)；
[0050]
3株组合双敲除ldha基因、atob基因、sucd基因的大肠杆菌：bl21
△
ldha
△
atob(命名为ab)、bl21
△
ldha
△
sucd(命名为ad)及bl21
△
atob
△
sucd(命名为bd)；
[0051]
1株敲除ldha基因、atob基因、sucd基因的大肠杆菌bl21
△
ldha
△
atob
△
sucd(命名为abd)。
[0052]
实施例2：重组质粒的构建及重组大肠杆菌的获得
[0053]
基因tfu_0875的ncbi登录号为mh157180；基因tfu_2399的ncbi登录号为mh157181；基因tfu_0067的ncbi登录号为mh157182；基因tfu_1647的ncbi登录号为mh157183；基因tfu_2576,2577(即tfu_2576
‑
7)的ncbi登录号为mh157194。
[0054]
ecorⅰ和hindⅲ双酶切处理质粒prsfduet
‑
1，凝胶回收纯化载体片段(3798bp)，用同样的方法酶切质粒puc57
‑
tfu_0875，凝胶回收纯化得到目的基因片段tfu_0875(如seq id no.1所示)，然后用t4dna连接酶连接两个片段，化转jm109感受态细胞中，挑取转化子进行菌落pcr验证，对阳性转化子提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为prsf
‑
0875。
[0055]
bglⅱ和kpnⅰ双酶切处理重组质粒prsf
‑
0875，凝胶回收纯化载体片段(4936bp)，利用相同的酶酶切质粒puc57
‑
tfu_2399(如seq id no.2所示)，凝胶回收目的基因片段，利用t4dna连接酶连接两个片段，化转jm109感受态细胞中，挑取转化子进行菌落pcr验证，对阳性转化子提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pad
‑
1。
[0056]
用相同的方法构建其他质粒，最终片段tfu_0067、tfu_1647(如seq id no.3所示)利用ncoⅰ和hindⅲ连接到质粒ptrc99a得到重组质粒pad
‑
4；片段tfu_2576、tfu_2577(如seq id no.4所示)利用ncoⅰ和hindⅲ连接到质粒pcdfduet
‑
1得到重组质粒pad
‑
6。
[0057]
将质粒pad
‑
1、pad
‑
4、pad
‑
6共同分别转入上述7株敲除菌株中，分别得到重组大肠杆菌a
‑
3，b
‑
3，d
‑
3，ab
‑
3，ad
‑
3，bd
‑
3及abd
‑
3。
[0058]
实施例3：重组大肠杆菌的摇瓶发酵及结果分析
[0059]
摇瓶发酵体系50ml。
[0060]
发酵培养基：
[0061]
sob培养基，成分为5g
·
l
‑1酵母粉，20g
·
l
‑1胰蛋白胨，5g
·
l
‑1nacl，2.03g
·
l
‑1mgcl2·
6h2o，0.186g
·
l
‑1kcl，4g
·
l
‑1葡萄糖，6.6g
·
l
‑1戊二酸，50μg
·
ml
‑1硫酸卡那霉素，50μg
·
ml
‑1氨苄青霉素，50μg
·
ml
‑1链霉素。
[0062]
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于装有50ml lb培养基的三角瓶中，37℃、250rpm
·
min
‑1摇瓶过夜。次日取1ml菌液转接于50ml lb液体培养基中，37℃、250rpm
·
min
‑1培养12
‑
16小时。
[0063]
发酵条件：将菌株按2％(2ml/100ml)的接种量，接种于发酵培养基中，37℃，250rpm
·
min
‑1培养至od为0.6
‑
0.8时加1mm iptg诱导重组菌，降温至30℃培养。
[0064]
结果分析：发酵过程中每12h取一次样，10000rpm
·
min
‑1离心2min后将发酵液与菌体分离，利用0.22μm水系滤膜处理发酵液，用于进行hplc(高效液相色谱法，美国bio
‑
rad hpx
‑
87h有机酸柱)检测，hplc检测中流动相为5mm h2so4，柱温35℃，紫外检测器波长为218nm。
[0065]
结果如图5所示，以大肠杆菌bl21(de3)无质粒菌株作为对照菌株，在相同条件下，bl21(de3)无质粒菌株没有产生庚二酸；所有包含pad
‑
1、pad
‑
4、pad
‑
6质粒的敲除菌株均产生了一定量的庚二酸，其中，菌株abd
‑
3的庚二酸产量最高，为108.43mg
·
l
‑1。
[0066]
实施例4：重组大肠杆菌的摇瓶发酵优化及结果分析
[0067]
1、外加无机盐种类优化
[0068]
发酵培养基：
[0069]
sob培养基，成分为5g
·
l
‑1酵母粉，20g
·
l
‑1胰蛋白胨，5g
·
l
‑1nacl，2.03g
·
l
‑1mgcl2·
6h2o，0.186g
·
l
‑1kcl，4g
·
l
‑1葡萄糖，6.6g
·
l
‑1戊二酸，50μg
·
ml
‑1硫酸卡那霉素，50μg
·
ml
‑1氨苄青霉素，50μg
·
ml
‑1链霉素；同时向培养基中外加不同浓度的无机盐溶液，对应无机盐种类及浓度分别为：kcl 25mm，mncl
2 0.5mm，mgso
4 5mm，kh2po
4 20mm。
[0070]
种子液制备：甘油保藏的abd
‑
3菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于装有50ml lb培养基的三角瓶中，37℃、250rpm
·
min
‑1摇瓶过夜，次日取1ml菌液转接于50ml lb液体培养基中，37℃、250rpm
·
min
‑1培养12
‑
16小时。
[0071]
发酵条件：将菌株按2％(2ml/100ml)的接种量，接种于发酵培养基中，37℃，200rpm
·
min
‑1培养至od为0.6
‑
0.8时加1mm iptg诱导重组菌，降温至30℃培养。
[0072]
结果如图7所示：以菌株abd
‑
3作为发酵菌株，外加不同种类不同浓度的无机盐，菌株庚二酸的产量随无机盐种类的变化而变化。外加5mm mgso4时，庚二酸产量有所提高；外加20mmkh2po4对于菌株合成庚二酸的贡献最大。
[0073]
2、外加kh2po4浓度优化
[0074]
发酵培养基：
[0075]
sob培养基，成分为5g
·
l
‑1酵母粉，20g
·
l
‑1胰蛋白胨，5g
·
l
‑1nacl，2.03g
·
l
‑1mgcl2·
6h2o，0.186g
·
l
‑1kcl，4g
·
l
‑1葡萄糖，6.6g
·
l
‑1戊二酸，50μg
·
ml
‑1硫酸卡那霉素，
50μg
·
ml
‑1氨苄青霉素，50μg
·
ml
‑1链霉素。
[0076]
同时向培养基中添加一定量的1m kh2po4溶液，控制培养基中kh2po4溶液的终浓度分别为0，5，10，20，30及50mm。
[0077]
种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于装有50ml lb培养基的三角瓶中，37℃、250rpm
·
min
‑1摇瓶过夜。次日取1ml菌液转接于50ml lb液体培养基中，37℃、250rpm
·
min
‑1培养12
‑
16小时。
[0078]
发酵条件：将菌株按2％(2ml/100ml)的接种量，接种于发酵培养基中，37℃，200rpm
·
min
‑1培养至od为0.6
‑
0.8时加1mm iptg诱导重组菌，降温至30℃培养。
[0079]
结果如图8所示：以菌株abd
‑
3作为发酵菌株，庚二酸产量随着培养基中kh2po4浓度的增加而增加。当培养基中kh2po4浓度为50mm时，庚二酸产量最高，为252.89mg
·
l
‑1，当培养基中kh2po4浓度为30mm时，庚二酸产量最高，为252.60mg
·
l
‑1。
[0080]
相关序列
[0081]
备注：
“”
为酶切位点，
“”
为rbs结合位点。
[0082]
seq id no.1基因片段tfu_0875(纯化后1188bp)
[0083]
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[0084]
seq id no.2基因片段tfu_2399(纯化后1209bp)
[0085]
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[0086]
seq id no.3基因片段tfu_0067、tfu_1647(纯化后1956bp)
[0087]
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[0088]
seq id no.4基因片段tfu_2576、tfu_2577(纯化后2046bp)
[0089]
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[0090]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。