检测EPAS1基因突变的引物、试剂盒和方法与流程

检测epas1基因突变的引物、试剂盒和方法
技术领域
1.本发明属于分子检测领域，特别涉及一种检测epas1基因突变的试剂盒和检测方法。


背景技术：

2.家族性红细胞增多症(familial erythrocytosis)是一种少见的常染色体显性遗传性血液病，它可能是先天性的(例如遗传)或后天性的，可分为原发性和次发性。由于该症的红细胞膜蛋白缺陷而导致红细胞膜结构异常，使其血液中球形红细胞增多。这些细胞的主要功能是将氧气从肺部输送到全身的组织和器官。
3.家族性红细胞增多症的症状和体征包括头痛、头晕、流鼻血和呼吸急促。过量的红细胞还会增加出现异常血凝块的风险，这种血凝块会阻塞动脉和静脉的血液流动。如果这些血块限制血液流向重要器官和组织(特别是心脏、肺或大脑)，就会导致危及生命的并发症，如心脏病发作或中风。然而，许多家族性红细胞增多症患者只有轻微的体征和症状，或从来没有任何与他们多余的红细胞相关的问题。
4.epas1被称为缺氧诱导因子2α(hif
‑
2α)，它属于氧代谢调节因子，参与了机体多种生命活动，在体内能量代谢、血管形成、炎症等多方面发挥重要的作用，目前研究表明epas1基因突变与红细胞增多症家族性4型有关，属于次生性发病因素。该基因位于2号染色体，16个外显子。缺氧诱导因子(hypoxia～induciblefactor，hif)是由α、β两个蛋白质亚基组成的异二聚体转录因子，1997年，由tian等克隆出内皮pas蛋白1(endothelialpasprotein
‑
1，epas1)即缺氧诱导因子2(hif2α)，为碱性螺旋
‑
环
‑
螺旋
‑
pas(bhlh
‑
pas)转录因子超家族成员，包含bhlh结构域、pas结构域、反式活化结构域及入核信号。hif2α与hif1α在结构上有许多相似之处，二者约有48％的氨基酸序列具有同源性。hif2αmrna在血管丰富的器官比如心脏、肺、胎盘中高度表达，而在白细胞中却少有表达。hif1 mrna虽可在人类所有组织中检测到，但在高度血管化的器官中表达水平并不高。hif2α通过缺氧反应元件(hypoxia
‑
responseelements，hres)调控下游靶基因，其靶基因的启动子或增强子上有一段＜100bp的dna序列，即为缺氧反应元件，其核心为5
’‑
tacgtgct
‑3’
序列。hif2a通过hres的识别序列与靶基因结合，诱导靶基因转录，从而介导细胞对缺氧的应答。epas1基因在人或小鼠的不同组织细胞内表达不同。在常压条件下epas1 mrna在血管丰富的肺、心脏、胎盘等组织内含量很高，而在白细胞中却少有表达。
5.范小伟等的研究发现rs75591953、rs75984373位点与降低汉族高原红细胞增多症(hapc)相关。另外，由于脾脏是破坏红细胞的主要器官，因此临床采用脾脏切除治疗家族性红细胞增多症的方法有较好的疗效，脾切除后虽然红细胞膜缺陷和球形红细胞依然存在，但由于除去了主要产生场所，红细胞寿命得以延长，使贫血获得纠正，因此，家族性红细胞增多症的早期诊断很重要，基因突变位点的检测能够在发病早期对疾病做预测。
6.epas1突变分析对家族性红细胞增多症遗传咨询及产前诊断具有重要意义，ecyt4的遗传方式为常染色体显性遗传。所以，先证者如致病基因明确，父母决定妊娠应及时进行
相关遗传咨询，在妊娠早期阶段进行产前分子诊断，一旦出现异常结果，需要明确是否可治疗，愈后如何等等，采取切实可行的诊治措施。最大限度减少异常胎儿的出生，提高新生儿人口素质。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种检测epas1基因突变的试剂盒，采用pcr技术，可用于快速检测患者体内epas1基因的突变情况。
8.检测epas1基因突变的引物，包括扩增epas1基因的引物，其碱基序列为：
[0009][0010][0011]
进一步地，所述引物还包括检测epas1基因的测序引物，其碱基序列为：
[0012]
m13 f：tgtaaaacgacggccagt
[0013]
m13 r：aacagctatgaccatg
[0014]
进一步地，所述引物扩增对应外显子为：
[0015][0016]
本发明还提供了一种检测epas1基因突变情况的方法，包括以下步骤：
[0017]
(1)抽提血液中的组织dna；
[0018]
(2)用pcr扩增步骤1中提取的dna；其中pcr扩增引物为：
[0019]
epas1
‑
1ftgtaaaacgacggccagtgcccagacgacctcataaacepas1
‑
1raacagctatgaccatgtctcagcactcttctcccaaepas1
‑
2ftgtaaaacgacggccagtggtcccaggcattggtagtepas1
‑
2raacagctatgaccatggctggtaaggctggcatctepas1
‑
3ftgtaaaacgacggccagtcatccctggcaaatgcctatepas1
‑
3raacagctatgaccatggcagggaggagactgaattgepas1
‑
4ftgtaaaacgacggccagtgaaggtggctcagcttactcepas1
‑
4raacagctatgaccatgcctctcaatgccccaatctcepas1
‑5‑
6ftgtaaaacgacggccagtcacaggtgctaagagagcagepas1
‑5‑
6raacagctatgaccatggggcactgatgcaatgaaacepas1
‑
7ftgtaaaacgacggccagtttgatttgccttctggggttepas1
‑
7raacagctatgaccatggggcataagtcttgtctgccepas1
‑
8ftgtaaaacgacggccagtcctggtcctcactgtcgtepas1
‑
8raacagctatgaccatgatcccactgttccaagacatcepas1
‑
9ftgtaaaacgacggccagtggtttccatgcatctaggggepas1
‑
9raacagctatgaccatggagcgtgtggtgttcttttgepas1
‑
10ftgtaaaacgacggccagtagggagtctctacgttgact
epas1
‑
10raacagctatgaccatggttactgccctgtatggggaepas1
‑
11ftgtaaaacgacggccagtgaacctttgggtccaggaagepas1
‑
11raacagctatgaccatgtaccctgtacccctacctctepas1
‑
12ftgtaaaacgacggccagtaggggataaacatgggggaaepas1
‑
12raacagctatgaccatgagagaagggctaaatggggtepas1
‑
13
‑
14ftgtaaaacgacggccagtgagactctgccttttgggtctepas1
‑
13
‑
14raacagctatgaccatgggtgaatggaagaaccaggatepas1
‑
15ftgtaaaacgacggccagttcccacacacccaacttttcepas1
‑
15raacagctatgaccatggaacttgtgaggaggttcccepas1
‑
16f
‑
1tgtaaaacgacggccagtattggtatcccccagtcacaepas1
‑
16r
‑
1aacagctatgaccatgtttaggaaaagccacgctgtepas1
‑
16f
‑
2tgtaaaacgacggccagtgtgaagggtcaactccaacgepas1
‑
16r
‑
2aacagctatgaccatgggacggggtcactataccatepas1
‑
16f
‑
3tgtaaaacgacggccagtccatgagatggtttagacgggepas1
‑
16r
‑
3aacagctatgaccatgacttcactttacattggcatagc
[0020]
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；测序引物碱基序列为：
[0021]
m13 f：tgtaaaacgacggccagt
[0022]
m13 r：aacagctatgaccatg；
[0023]
(4)对测序结果进行判断，确定epas1基因是否发生变异。
[0024]
本发明最后提供了一种检测epas1基因突变位点的试剂盒，包括：
[0025]
(i)血液dna抽提试剂；
[0026]
(ii)检测体系pcr扩增反应液；包括扩增epas1基因的引物，其碱基序列为：
[0027]
epas1
‑
1ftgtaaaacgacggccagtgcccagacgacctcataaacepas1
‑
1raacagctatgaccatgtctcagcactcttctcccaaepas1
‑
2ftgtaaaacgacggccagtggtcccaggcattggtagtepas1
‑
2raacagctatgaccatggctggtaaggctggcatctepas1
‑
3ftgtaaaacgacggccagtcatccctggcaaatgcctatepas1
‑
3raacagctatgaccatggcagggaggagactgaattgepas1
‑
4ftgtaaaacgacggccagtgaaggtggctcagcttactcepas1
‑
4raacagctatgaccatgcctctcaatgccccaatctcepas1
‑5‑
6ftgtaaaacgacggccagtcacaggtgctaagagagcagepas1
‑5‑
6raacagctatgaccatggggcactgatgcaatgaaacepas1
‑
7ftgtaaaacgacggccagtttgatttgccttctggggttepas1
‑
7raacagctatgaccatggggcataagtcttgtctgccepas1
‑
8ftgtaaaacgacggccagtcctggtcctcactgtcgtepas1
‑
8raacagctatgaccatgatcccactgttccaagacatcepas1
‑
9ftgtaaaacgacggccagtggtttccatgcatctaggggepas1
‑
9raacagctatgaccatggagcgtgtggtgttcttttgepas1
‑
10ftgtaaaacgacggccagtagggagtctctacgttgact
epas1
‑
10raacagctatgaccatggttactgccctgtatggggaepas1
‑
11ftgtaaaacgacggccagtgaacctttgggtccaggaagepas1
‑
11raacagctatgaccatgtaccctgtacccctacctctepas1
‑
12ftgtaaaacgacggccagtaggggataaacatgggggaaepas1
‑
12raacagctatgaccatgagagaagggctaaatggggtepas1
‑
13
‑
14ftgtaaaacgacggccagtgagactctgccttttgggtctepas1
‑
13
‑
14raacagctatgaccatgggtgaatggaagaaccaggatepas1
‑
15ftgtaaaacgacggccagttcccacacacccaacttttcepas1
‑
15raacagctatgaccatggaacttgtgaggaggttcccepas1
‑
16f
‑
1tgtaaaacgacggccagtattggtatcccccagtcacaepas1
‑
16r
‑
1aacagctatgaccatgtttaggaaaagccacgctgtepas1
‑
16f
‑
2tgtaaaacgacggccagtgtgaagggtcaactccaacgepas1
‑
16r
‑
2aacagctatgaccatgggacggggtcactataccatepas1
‑
16f
‑
3tgtaaaacgacggccagtccatgagatggtttagacgggepas1
‑
16r
‑
3aacagctatgaccatgacttcactttacattggcatagc
[0028]
(iii)测序体系试剂；包括检测epas1基因的测序引物，其碱基序列为：
[0029]
m13 f：tgtaaaacgacggccagt
[0030]
m13 r：aacagctatgaccatg。
[0031]
有益效果：本发明设计了扩增epas1外显子序列1
‑
16的引物。通过加接头，使16对引物的pcr产物均可以用一种测序引物进行测序。采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。epas1基因的突变类型种类繁多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述epas1外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度。荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。
附图说明
[0032]
图1为epas1基因在染色体上定位图。
[0033]
图2为外显子1
‑
16引物的电泳图，m为marker dl 2000，如图所示，引物均扩增有效，条带明亮。
[0034]
图3是epas1第2外显子测序演示图。
[0035]
图4是epas1第6外显子测序演示图。
[0036]
图5是epas1第16外显子测序演示图。
具体实施方式
[0037]
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0038]
实施例1
polymerase(1u/μl)；epas1基因外显子序列的上、下游引物引物引物浓度均为10μm。
[0049]
测序体系试剂包括：测序纯化液(exoi:0.6u，cip:1.2u)、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测epas1基因外显子序列的上、下游引物分别为m13
‑
f(3.2μm)、m13
‑
r(3.2μm)，以及bigdye terminator v3.1(购买自美国applied biosystems公司)。
[0050]
实施例2
[0051]
血液/细胞/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
[0052]
(1)抽提血液中的组织dna：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2
‑
5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0053]
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份19μl分装：
[0054]
x＝19μl反应液
×
(n份标本+1份空白对照)
[0055]
n为检测标本数。
[0056]
(3)加样：加入检测体系pcr反应液中1μl dna；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
[0057]
(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abi veriti(美国applied biosystems公司)等。反应条件如下：
[0058][0059][0060]
pcr扩增体系试剂配制方法如下：
[0061][0062]
其中，引物序列为：
[0063][0064]
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，25min，凝胶成像系统观察。
[0065]
如图2所示，即血液样本以epas1
‑
1f\r、epas1
‑
2f\r、epas1
‑
3f\r、epas1
‑5‑
6f\r、epas1
‑
7f\r、epas1
‑
8f\r、epas1
‑
9f\r、epas1
‑
10f\r、epas1
‑
11f\r、epas1
‑
12f\r、epas1
‑
13
‑
14f\r、epas1
‑
15f\r、epas1
‑
16
‑
1f\r、epas1
‑
16
‑
2f\r、epas1
‑
16
‑
3f\r为引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度为915、548、570、334、744、338、473、472、645、368、843、714、530、885、691、893bp，通过电泳图的分析表明本发明所述引物均扩增有效，且条带单一。
[0066]
(6)sanger测序：
[0067]
取9μl pcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
[0068][0069]
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
[0070][0071]
反应程序：
[0072][0073]
沉淀环节：
[0074]
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl hi
‑
di后进行变性试验。
[0075]
变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。
[0076]
(7)结果判断：分别将测序结果与epas1野生型参考序列
[0077]
(genbank：ng_016000.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
[0078]
实施例3
[0079]
取1例临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份检测体系pcr反应液中加入样本1μl。电泳结果如图2所示，条带单一明亮，表明本发明所述引物epas1
‑
1f\r、epas1
‑
2f\r、epas1
‑
3f\r、epas1
‑5‑
6f\r、epas1
‑
7f\r、epas1
‑
8f\r、epas1
‑
9f\r、epas1
‑
10f\r、epas1
‑
11f\r、epas1
‑
12f\r、epas1
‑
13
‑
14f\r、epas1
‑
15f\r、epas1
‑
16
‑
1f\r、epas1
‑
16
‑
2f\r、epas1
‑
16
‑
3f\r对血液样本扩增有效。
[0080]
通过测序结果分析(见图3，4)可以看出，本发明所述引物已经把外显子都包括在内了，能够扩增出epas1基因的全外显子，并且测序结果准确。