烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用的制作方法

烟草磷吸收负调控基因ntspx4及其应用
技术领域
1.本发明涉及烟草磷代谢技术领域，具体涉及一种烟草磷吸收负调控基因ntspx4及其应用。


背景技术：

2.磷是烟草生长发育过程中最重要的营养元素之一，参与体内多种代谢过程，缺磷会抑制细胞的分裂和增殖，造成烟株生长缓慢，根系发育不良，推迟成熟期，叶片狭小，叶色暗绿，调制后的叶片缺乏光泽，油分不足，影响主要化学成分的含量及比例，品质低劣。据调查统计，我国约有2/3的土壤缺磷，并且由于土壤对磷的强烈化学固化作用，土壤中可吸收利用的有效磷极度缺乏。
3.因此，通过分子手段提高烟草对磷的吸收和利用效率，具有重要的生产意义。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是提供一种烟草磷吸收负调控基因ntspx4及其应用，以期解决现有技术中缺磷土壤影响烟草生长的技术问题。
5.为解决上述技术问题，本发明克隆了一种烟草磷吸收负调控基因ntspx4，其核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
6.植物中含有spx结构域的蛋白质参与磷酸盐稳态，包括磷转运和对磷缺乏的适应。但目前关于spx4基因在烟草磷吸收转运中的功能还未见报道。本发明首次发现了两个烟草磷吸收负调控基因ntspx4-1和ntspx4-2。
7.基于上述两个烟草磷吸收负调控基因ntspx4-1和ntspx4-2，本发明构建了一种烟草磷吸收负调控基因敲除载体，包括位于所述基因36～55 bp处的grna靶位点序列；所述序列如seq id no.3所示。
8.本发明将上述烟草磷吸收负调控基因敲除载体转化宿主菌，构建了一种由所述的敲除载体构建的重组菌。
9.作为本发明的优选实施方式，所述重组菌为农杆菌gv3101菌株。
10.为改良磷高效烟草品种，本发明提供了一种敲除烟草磷吸收负调控基因的方法，包括以下步骤：（1）将所述的敲除载体构建的重组菌侵染烟草叶片；（2）将所述侵染后的叶片转移到分化培养基上进行分化培养和筛选；（3）将所述筛选出的分化芽转至生根培养基上成苗，即成。
11.作为本发明的优选实施方式，在所述步骤（2）中，所述分化培养基为添加有0.15 mg
·
l-1 naa，1 mg
·
l-1 6ba和500 mg
·
l-1
噻孢霉素的ms培养基。
12.作为本发明的优选实施方式，在所述步骤（3）中，所述生根培养基为添加有0.1 mg
·
l-1
naa和500 mg
·
l-1
噻孢霉素的ms培养基。
13.作为本发明的优选实施方式，所述ms培养基还添加有6.0～8.0 mg
·
l-1
潮霉素。
14.最后，本发明将所述的基因、载体、重组菌或方法在磷低效的烟草品种进行定向改良中应用。
15.与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：本发明克隆的烟草ntspx4-1、ntspx4-2基因为烟草磷吸收负调控基因，ntspx4基因敲除可显著提高烟株有效磷含量，促进植株生长发育和物质积累，可利用该基因对磷低效的烟草品种进行定向改良，培育磷高效烟草品种。
附图说明
16.图1为ntspx4
‑ꢀ
crispr/cas 9基因敲除载体结构图。
17.图2为ntspx4-ko株系中ntspx4基因突变检测结果图。
18.图3为不同磷浓度处理对烟苗生长发育和物质积累的影响；图中，a为磷浓度为10 mmol
·
l-1
的高磷hoagland溶液中烟苗生长情况；b为磷浓度为1 mmol
·
l-1
的标准hoagland溶液中烟苗生长情况；c为磷浓度为0.005 mmol
·
l-1
的低磷hoagland溶液中烟苗生长情况；d为不同磷浓度处理对烟苗鲜重测定柱状图。
19.图4为不同磷浓度处理下速效磷含量测定柱状图。
具体实施方式
20.下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
21.在以下实施例中所涉及的分析软件如无特别说明，均为常规软件；所涉及的方法，如无特别说明，均为常规方法。所设涉及的试剂，如无特别说明，均为常规市售试剂。
22.实施例一：烟草中ntspx4基因的克隆根据水稻中的osspx4基因序列为基础，利用primer primer 5.0软件设计上下游引物 (f1：atgaaattcgggaaagaattta，r1：ctattctggtggatgggaatcc)。以烟草（品种k326）叶片cdna为模板进行扩增，扩增产物进行测序，获得了两条与水稻osspx4基因高度同源的基因序列，其编码的蛋白在n端均具有一个典型的单一的spx结构域，分别命名为ntspx4-1、ntspx4-2。ntspx4-1的cds序列如seq id no.1所示， ntspx4-2的cds序列如seq id no.2所示。
23.实施例2：ntspx4基因敲除载体ntspx4
‑ꢀ
crispr/cas 9的构建根据ntspx4-1和ntspx4-2的cds序列，在36～55 bp处设计grna靶位点序列（targeting sequence：agaaaccctacccgaatggaggg），并添加bsai酶切位点。化学合成靶位点序列及其反向互补序列，退火后形成oligo二聚体，oligo二聚体与crispr/cas 9载体经bsai酶切后进行连接，反应体系如下：crispr/cas 9载体2.0 μl，oligo二聚体1.0 μl，enzyme mix 1.0 μl，无菌水补充至10.0 μl，将连接产物转化至大肠杆菌dh5α中培养，挑选阳性菌斑，提质粒进行测序，获得ntspx4
‑ꢀ
crispr/cas 9基因敲除载体，载体如图1所示。
24.实施例3：ntspx4基因敲除株系的创制采用冻融法将ntspx4
‑ꢀ
crispr/cas 9基因敲除载体转入农杆菌gv3101菌株，烟草转化采用叶盘转化法，侵染后的叶片转移到含有6.0 mg
·
l-1
潮霉素的分化培养基（ms培养基+0.15 mg
·
l-1 naa+1 mg
·
l-1 6ba+500 mg
·
l-1
噻孢霉素）上进行分化培养和筛选，分化
芽转至含有8.0 mg
·
l-1
潮霉素的生根培养基（ms培养基+0.1 mg
·
l-1
naa+500 mg
·
l-1
噻孢霉素）上成苗。提取潮霉素抗性植株的dna，在靶位点上下游设计引物（f5：tcgggaaagaatttacaacgc，r5：caattcctggaagcgaataat）进行pcr扩增，对pcr产物进行测序筛选靶位点发生碱基突变的株系，所得ntspx4基因敲除株系其命名为ntspx4-ko，该株系中ntspx4-1与ntspx4-2均在第52 bp处插入一个碱基t，这导致了ntspx4的移码突变，蛋白翻译提前中止（如图2所示）。
25.实施例4：低磷及高磷处理对ntspx4-ko及对照株系生长发育和物质积累的影响烟草种子消毒后，均匀等量的点在浸透蒸馏水的海绵上（30 cm
×
20 cm
×
1 cm），置于培养箱中暗培养，种子露白后进行光照培养。待烟苗长至两叶一心期时，将海绵转移至不同磷浓度的hoagland溶液中进行培养。高磷处理（hp）中磷浓度为10 mmol
·
l-1
、对照处理（mp）中磷浓度为1 mmol
·
l-1
、低磷处理（lp）中磷浓度为0.005 mmol
·
l-1
，其它元素浓度保持一致。低磷处理用kcl补充溶液中的k
+
，高磷处理用nah2po4补充溶液中的pi，调节ph至6.0。培养过程中，每天定时定量更换溶液，观察记录烟苗的生长发育状况。
26.如图3所示，在磷浓度为1 mmol
·
l-1
的标准hoagland溶液（mp）中，ntspx4-ko株系与对照生长发育正常，二者无明显差异；在磷浓度为10 mmol
·
l-1
的高磷hoagland溶液（hp）中，ntspx4-ko株系与对照相比生长发育受到抑制，对照茎围较粗，株高较高，叶片较大，说明高磷对ntspx4-ko株系生长有一定抑制作用；在磷浓度为0.005 mmol
·
l-1
的低磷hoagland溶液（lp）中，ntspx4-ko株系与对照生长发育均受到抑制，发育迟缓，叶色深绿，叶片变厚，但总体上ntspx4-ko株系株高较高，叶片数较多，叶片较大，生长势优于对照。
27.处理20天后，将海绵上的烟株取出称重，每个处理10个生物学重复，进行烟苗生物量的测定。如图3中d所示，对照烟苗的鲜重随着磷浓度的升高而增加，ntspx4-ko株系在正常磷浓度下生物量积累最高，在高磷和低磷条件下生物量减少，高磷条件下ntspx4-ko株系的生物量较对照降低了约45%左右，低磷条件下ntspx4-ko株系的生物量较对照提高了39%左右。
28.如图4所示，处理20天后，每个处理取5株烟苗，混合均匀，进行有效磷含量的测定。结果表明，在低磷、高磷以及正常磷浓度处理下，ntspx4-ko株系中可利用的有效磷含量均极显著高于对照。
29.综上，本发明实施例克隆的烟草ntspx4-1、ntspx4-2基因为烟草磷吸收负调控基因，ntspx4基因敲除可显著提高烟株有效磷含量，促进植株生长发育和物质积累，因而，利用该基因对磷低效的烟草品种进行定向改良具有重要的生产意义。
30.上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。