炭耦合复合型菌剂及其制备方法与应用

1.本发明涉及生物质资源化利用和环境污染物治理技术领域，特别是一种炭耦合复合型菌剂及其制备方法与运用。
2.

背景技术：

3.全国土壤环境情况并不乐观，在加大生产力发展的同时，也对水体和土壤造成了严重的损坏。而其中，又以南方土壤问题最为突出，其主要原因是由于工业产业的不断发展。据估计，我国受农药、重金属等污染的土壤面积达数十万km2，其中矿区污染土壤达2万 km2、石油污染土壤约5万km2、固废堆放污染土壤约500km2，已对我国生态环境质量、食品安全和社会经济持续发展构成严重威胁。人类活动是造成土壤污染的主要因素，农药污染源、，部分重金属污染物带有较大的毒性，并且具有较强迁移性。在经济发达的沿海地区,土壤污染的状况十分复杂，土壤污染呈现多样性和复杂性特点,表现为污染途径的多样性（大气污染型、水污染型、固体污染型等）和污染来源的多样性（工业污染源、农业污染源、生活污染源、交通污染源、地质作用等）。由单一污染物的研究向复合污染物研究的发展，是当代环境问题的典型趋势，也是修复手段趋向成熟的阶段。
4.多环芳烃和重金属都是环境中的微量持久性污染物，可同时在环境中被检测到。多环芳烃被认为是致癌性、致畸性和致突变性污染物，其中菲(phe)、芘(pyr)和苯并[a]芘(bap)因具普遍性和分布性而被广泛讨论。从土壤中清除多环芳烃是当务之急，因为它们通过食物链对人类健康构成严重威胁。但在重金属存在的情况下，多环芳烃的修复具有挑战性，因为重金属会影响atp的产生、c-矿化、群落转移和酶功能等，从而损害微生物活性。
[0005]


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供能在重金属胁迫下降解有机污染物的一种炭耦合复合型菌剂的制备方法。
[0007]
本发明提供的技术方案是：一种炭耦合复合型菌剂的制备方法，包括以下步骤：s1、将可炭化天然材料进行处理，得到炭基材料，作为后续耦合材料之一；s2、采集典型污染点位土壤的土壤样品制得土壤悬浮液，使用扩散室原位培养法对土壤中的微生物进行分离培养，得到含有目标菌株的土壤微生物富集液；s3、对富集液进行多个周期的菌种筛选驯化，得到能在重金属胁迫下对多环芳烃有降解能力的菌种；s4、对上述有降解能力的菌种使用平板涂布法进行分离纯化，得到降解菌的纯菌落；s5、重复步骤s4，分别收集至少3个菌种纯化后的菌体，用lb液体培养基富集培养
至od600=1.0～1.2，收集菌液冷冻保存；s6、将活化后的多种菌液以一定的比例进行混合，得到复合菌种子液，作为耦合材料之一；s7、将复合菌种子液与炭基材料按比例混合培养一段时间后，进行固定化处理，得到复合型菌剂。
[0008]
优选地，步骤s1中所述的可炭化天然材料包括玉米秸秆、螃蟹壳、茄子秆、竹叶、木棉纤维和鹿粪中的一种或多种。
[0009]
优选地，步骤s1中通过以下步骤将可炭化天然材料进行处理：s11、将可炭化天然材料洗净除杂、干燥并粉碎为粉末；s12、经过300～700 ℃隔氧闷烧高温慢裂解1～3小时；s13、在保护气体和冷凝循环水保护下冷却至室温，依次经过研磨过筛，盐酸浸泡活化，蒸馏水洗涤和烘干后得到炭基材料。
[0010]
优选地，所述典型污染点位土壤是指农药污染农田、石油烃污染土壤、红树林根系土壤、制造工厂附近土壤或干涸泥床土壤。
[0011]
优选地，所述的土壤悬浮液通过以下方法制得：称取10g土壤样品，加入90ml灭菌超纯水，混匀后进行超声处理，然后静置30～60min，获取含有微生物的上清液；超声处理条件为超声波振幅40μm，超声时间为10s，间隔5s，进行2次。
[0012]
优选地，步骤s2中，扩散室原位培养法的过程如下：s100、配制原位培养基：取土壤采样点附近的水1l，自然ph值，加入1%(wt/vol)琼脂粉混匀，高温灭菌后降温至45℃，得到温琼脂；s200、接种和组装扩散室：将已灭菌的0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜用密封胶与已灭菌的不锈钢垫圈的底面贴好，向中空内环引入土壤悬浮液和温琼脂的混合物，然后将0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜和不锈钢垫圈顶面用胶水密封，形成一个密封室；s300、将扩散室埋于原始采样位置或模拟自然环境中进行孵育，深度为5～10cm；孵育1周后，将原位培养装置取回、清洁后，将原位培养基转移到无菌1.5ml的ep管中，加入无菌水，将原位培养基捣碎并充分与无菌水混匀，离心得到菌悬液。
[0013]
优选地，步骤s3中，菌种驯化的过程如下：吸取步骤s2中的菌悬液涂布于新扩散室的驯化培养基中，使用扩散室在原位培养四个驯化周期，每周期将菌悬液转接到新构建的 扩散室中，设置四个不同浓度梯度的驯化培养基，在原位培养基中添加一定浓度的有机污染物和重金属进行筛选和驯化能在胁迫下对目标污染物有降解能力的菌种。
[0014]
优选地，步骤s7中，复合菌种子液与炭基材料按1:10～30（w/v）的比例混合培养。
[0015]
优选地，步骤s7中，所述的固定化处理为将复合菌液与炭基材料按照1:10～30（w/v）的比例混合培养12～24h，完成吸附耦合后，在无菌环境下过筛网，保留固体材料并干燥。
[0016]
优选地，步骤s7中，所述的固定化处理为将复合菌种子液与炭基材料按比例混合培养一段时间后，加入等体积的耦合辅助剂，搅匀后逐滴滴入固化液中，固化或凝胶化后用无菌水反复清洗，自然晾干。
[0017]
优选地，所述研磨过筛是经过20～100目筛；所述盐酸溶液浓度为1～3 mol/l。
[0018]
优选地，收集3种菌液，并将3种菌液以1:1:1、1:1:2、1:2:1或2:1:1的比例进行混合。
[0019]
优选地，所述的等体积的耦合辅助剂和对应的固化液为3%～5%的海藻酸钠对应2%氯化钙溶液作固化液或4%～6%的壳聚糖对应1mol/l氢氧化钠作固化液。
[0020]
本发明还提供了一种采用上述的炭耦合复合型菌剂的制备方法制备得到的炭耦合复合型菌剂。
[0021]
本发明同时也提供了上述的炭耦合复合型菌剂在污染物治理和土壤修复中的应用。
[0022]
本发明的有益效果在于：1、本发明制备工艺简单，经济成本低，利用玉米秸秆、螃蟹壳、竹叶、茄子杆和鹿粪等废弃生物质为载体材料，利用污染土壤自行提取合成目的菌群，价格低廉，原料充足易得，且材料的组合搭配具有灵活性，实验室内即可完成，不仅可将废弃资源二次利用且有益于环境保护；2、本发明首次利用茄子杆、鹿粪、螃蟹壳制成炭基材料作为耦合载体使用，并且首次将壳聚糖用作耦合辅助剂制备菌炭凝胶球，为制备特定功能的固定化菌剂提供更多选择；3、本发明使用扩散室原位培养法分离筛选目标菌株，扩散室旨在通过创建一种非常接近于自然栖息地的孵化策略，从根本上“诱骗”细胞认为它们是在自然环境中生长的；与传统的实验室培养方法相比，原位培养法可能获取到传统“不可培养”微生物，也能使菌株保持自然环境与微生物之间的共生关系，最重要的一点是，可以控制获取的目标菌株不脱离其治理环境的生存条件而产生变异，这有益于后续制备的复合菌剂在其原位治理污染物时更好的保持其活性，更好的发挥其性能。
[0023]
4、本发明提供了使用炭基材料耦合以三株分别属于假单胞菌属（pseudomonas）、芽孢杆菌属（bacillus）和分枝杆菌属（cytobacillus）的菌株组成的复合菌群，与现有的使用单一菌种的技术相比，其稳定性更强，在复杂环境中建立耐受与取得竞争优势的可能性更大，可降解的组分也更大，更有利于改善土壤群落丰富的及多样性，对微生物群落组成与根系微生物效应有显著影响；5、本发明制备的菌剂中，生物炭自身具有较高的孔隙结构和比表面积等特性，可快速将污染物吸附至孔径中或周边形成团聚体，再通过携带的耐重金属的降解菌群对污染物进行吸附和代谢降解，还可固定重金属，达到在短时间内降低土壤威胁，在复合污染环境中达到优秀的降解效果；6、本发明制备的炭耦合复合型菌剂机械强度和传质性能较好，环境持久性及稳定性较强，利用该菌剂降解多环芳烃污染液体培养基时，当芘初始浓度为50mg/l时，添加2%（w/v）复合菌剂，经过7d的培养试验，不同组分降解率均在70%以上，且降解率最高可达95.77%，可安全有效的治理环境污染物，故在污染物治理和土壤修复中具有广阔的应用前景。
附图说明
[0024]
图1为炭耦合复合型菌剂的制备流程示意图；
图2为9种生物炭耦合载体的产率示意图；图3为9种生物炭耦合载体的扫描电镜图；图4为扩散室的分解示意图；图5为单一菌种和复合菌群对芘降解能力示意图；图6为海藻酸钠包埋制成的复合菌剂对芘降解能力示意图；图7为壳聚糖包埋制成的复合菌剂对芘降解能力示意图；图8为吸附耦合制成的复合菌剂对芘降解能力示意图；图9为不同炭基材料通过三种耦合方式制成的复合菌剂对芘降解能力对比示意图。
具体实施方式
[0025]
下面结合附图1至附图9对本发明作进一步阐述：实施例一：如图1所示的一种炭耦合复合型菌剂的制备方法，包括以下步骤：s1、将可炭化天然材料进行处理，得到炭基材料，作为后续耦合材料之一；作为耦合材料之一的炭基材料的制备：将收集到的茄子秸秆去除杂质后，用自来水洗涤干净，自然风干后置于105 ℃烘箱内烘干12小时，经粉碎机粉碎成粉末后放入气氛箱式炉，密封，抽真空，通入保护气体氮气，以5～10℃/min的速度快速升温至300～700 ℃中某个设定温度，然后继续隔氧裂解1～3小时。在本实施例中，以5℃/min的速度快速升至500 ℃，继续隔氧裂解2小时，产生的废气由抽风系统抽走防止污染环境，热解过程产生的蒸汽部分冷凝得到的生物焦油回收利用。通入气氛炉中的保护气体也可为氦气或氩气等惰性气体，通过抽真空和通入保护气体使气氛炉内腔形成缺氧或绝氧状态。
[0026]
冷却至室温，然后取出产物，研磨过80目筛，用1 mol/l盐酸浸泡活化，蒸馏水洗涤和烘干后得到茄子秆生物炭（记为500qz），500qz的产率为35.21%，ph为10.38。
[0027]
在其它的实施例中，采用鹿粪或玉米秸秆替代茄子杆制备生物炭耦合载体，得到的鹿粪生物炭和玉米秸秆生物炭分别记作500lf和500ym，其他操作条件与茄子秸秆制备茄子秆生物炭的条件相同。
[0028]
将茄子杆、鹿粪和玉米秸秆制备生物炭耦合载体的升温温度设定为300或700℃，得到的相应的生物炭分别对应记作300qz、300lf、300ym、700qz、700lf、700ym，他操作条件与茄子秸秆制备茄子秆生物炭的条件相同。
[0029]
图2所示的为上述9种生物炭耦合载体的产率，可以看出在300℃制备温度下，三种材料鹿粪、茄子秆和玉米秸秆的产率最大，700℃制备的生物炭产率最低。图3所示的为9种生物炭耦合载体的扫描电镜图，可以看出300℃制备的生物炭表面光滑，几乎无孔隙结构，而500℃和700℃制备的的生物炭表面粗糙，表层和内部有很多大小不一的孔隙结构，根据结果分析这种结构有利于微生物的附着生长。
[0030]
s2、采集典型污染点位土壤的土壤样品，使用扩散室原位培养法，富集培养有降解效果的目标菌种；典型污染点位土壤是指农药污染农田、石油烃污染土壤、重金属污染土壤、电子厂等制造工厂附近土壤、红树林根系土壤、干涸泥床等长期污染或中重度污染土
壤。
[0031]
结合图4，介绍扩散室原位培养法的过程如下：配制原位培养基：取土壤采样点附近的水1l，自然ph值，加入1%(wt/vol)琼脂粉混匀，高温灭菌后降温至45℃备用（温琼脂）。将已灭菌的0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜1用密封胶与已灭菌的不锈钢垫圈2的底面贴好，向中空内环引入3ml接种物3（土壤悬浮液与温琼脂的混合物，土壤悬浮液添加量为1%）至离顶端有一层薄薄空气层的位置，然后将0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜1和不锈钢垫圈2上端面用胶水密封，形成一个密封室（膜允许腔室和环境之间的物质交换，但限制细胞的运动）。
[0032]
接种和组装后，将扩散室埋于原始采样位置或模拟自然环境中进行孵育，深度为5～10cm。孵育1周后可以观察到大量不同形态的菌落，将扩散室取回清洁后，将原位培养基转移到无菌1.5ml的ep管中，加入无菌水，将原位培养基捣碎并充分与无菌水混匀，离心得到菌悬液。
[0033]
s3、对目标菌种进行多个周期的菌种驯化，得到能在重金属胁迫下对多环芳烃有降解能力的菌种；菌种驯化的过程如下：吸取步骤s2中原位富集培养后的菌悬液涂布于新的扩散室的驯化培养基中，使用扩散室在原位培养多个驯化周期，每个驯化周期结束后，将菌悬液转接到新构建的扩散室中。通过在上述原位培养基中添加一定浓度的有机污染物和重金属得到驯化培养基。多个驯化周期中驯化培养基中有机污染物的浓度依次增加，通过多个驯化周期筛选和驯化能在胁迫下对目标污染物有高效降解能力的菌种。
[0034]
s4、对上述有降解能力的菌种使用平板涂布法进行分离纯化得到降解菌的纯菌落；s5、重复步骤s4，分别收集至少3个菌种纯化后的菌体，用lb液体培养基富集培养至od600=1.0～1.2，收集菌液冷冻保存；s6、将活化后的多种菌液以一定的比例进行混合，得到复合菌种子液，作为耦合材料之一；s7、将复合菌种子液与炭基材料按比例混合培养一段时间后，进行固定化处理，得到复合型菌剂。
[0035]
本实施例以耐重金属的多环芳烃高效降解菌群的构建为例对上述步骤s2～s6详细进行阐述。
[0036]
耐重金属的多环芳烃高效降解菌群的构建方法如下：1）采取东莞市望牛墩镇某工业园附近受 pahs 和重金属污染的污染农田土壤作为提取菌种的菌源，称取10g污染土壤，加入 90ml 无菌超纯水中，使用超声波振幅40μm，一次10s，分两次进行超声处理，每次间隔5s，以去掉土壤上的微生物，静置30min得到土壤悬浮液。将已灭菌的0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜1用密封胶与已灭菌的不锈钢垫圈2的底面贴好，向中空内环引入接种物3至离顶端有一层薄薄空气层的位置，然后将0.03μｍ孔径聚碳酸酯膜1和不锈钢垫圈2上端用胶水密封，形成一个密封室。接种和组装后，将扩散室埋于原始采样位置或模拟自然环境中，深度为5～10cm,进行孵育。
[0037]
将扩散室取回清洁后，将原位培养基转移到无菌1.5 ml的ep管中，加入无菌水，将原位培养基捣碎并充分与无菌水混匀，离心得到菌悬液。在容器中加入过0.22μm滤头的
10g/l的芘母液5ml，完全挥发后加入1l原位培养基制成驯化培养基，芘的终浓度为50mg/l，并添加人工配置的硝酸镉溶液，添加量为50mg/l。吸取菌悬液涂布于新扩散室的驯化培养基中，使用扩散室在原位培养，一个驯化周期为7天。
[0038]
7天后，将扩散室中的驯化培养基转移到无菌1.5 ml的ep管中，加入无菌水，将驯化培养基捣碎并充分与无菌水混匀，离心得到菌悬液，再将制得的菌悬液转接到新构建的扩散室中进入下一个驯化周期，如此循环。共进行四个驯化周期，四个驯化周期的芘浓度分别为50 mg/l、100 mg/l、150 mg/l和200 mg/l，并添加人工配置的硝酸镉溶液，添加量为50mg/l，4个周期后完成筛选驯化培养pahs 降解菌的过程。
[0039]
2）将最终获得的菌悬液按照梯度稀释，稀释浓度为 10-3
、10-5
、10-7 ，再分别涂布在无机盐固体平板上，芘用升华法成膜覆盖在涂布有稀释富集液的无机盐固体平板上，将平板置于恒温培养箱中（37℃）避光培养，观察平板培养基，菌株周围出现透明光圈为对芘有降解能力的菌株。
[0040]
3）首先挑取对芘有降解能力的菌株，用灭菌后的接种环轻轻小心地在 lb 固体培养基上挑取三分之一环的菌落，然后在新的lb培养基上划线三次平板划线分离纯化得到降解菌的纯菌落，即为筛选分离得到的降解菌，最终得到了三株对芘有高效降解能力的纯菌落。经检测得知筛选出的三种对芘有高效降解效果的又同时对重金属有很强耐受性的纯菌株，经鉴定分别属于芽孢杆菌属（bacillus）、分枝杆菌属（cytobacillus）和假单胞菌属（pseudomonas），分别记作p1、p2和p3。
[0041]
4）将上述三种菌株在lb平板上划线，使其活化，再将获得的单菌落接种到lb液体培养基中在摇床中避光培养（37℃，180 r
·
min-1
），获得 od600在1.0 左右的菌株种子液。
[0042]
5）将三个菌株种子液按1:1:1的比例进行混合，构建成在重金属胁迫下对芘有降解能力的复合菌群（记作hh1），其在7d对50mg/l芘的去除率为81.08%，高于任一单菌株的去除效果。
[0043]
在其它的实施例中，p1、p2和p3的菌株种子液以分别以1:1:2、1:2:1、2:1:1的比例进行混合，混合后的复合菌群分别记作hh2、hh3、hh4。
[0044]
单一菌种p1、p2和p3以及复合菌种hh1、hh2、hh3、hh4其在7d对50mg/l芘的去除效果如图5所示。从图5中可以看出，复合菌种的降解效果比单一菌种有所提高，其中hh1的降解效果最好，说明三种菌株种子液的最佳混合比例是1:1:1。
[0045]
在本实施例中以海藻酸钠作耦合辅助剂制备复合型菌剂，其方法如下：将炭基耦合载体500lf与复合菌群hh1按照1:30（w/v）的比例混合，置于摇床中37℃、180 r
·
min-1 的条件下振荡 2 h后，加入等体积的4%海藻酸钠溶液，搅匀静置30min后，用蠕动泵逐滴滴入2%的氯化钙溶液中，固化12h后用无菌纱布包裹过滤，并用无菌水反复冲洗，得到的黑色硬质小球就是复合菌剂（记作500lfph），其在7d对50mg/l芘的去除率为93.01%，比hh1的降解率提高了12%。
[0046]
在其它实施例中，我们可以用其它炭基耦合载体与其它复合菌群中hh2等生成相应的复合菌剂。例如，我们使用炭基材料300qz、300lf、300ym、500qz、500ym、 700qz、700lf、700ym替代500lf与复合菌群hh1混合，在相同条件下得到相应的复合菌剂300qzph、300lfph、300ymph、500qzph、500ymph、 700qzph、700lfph、700ymph。
[0047]
图6所示的为上述几种以海藻酸钠作辅助剂的复合菌剂小球，其在7d对50mg/l对
芘的降解效果示意图，从图中可以看出，以海藻酸钠做辅助剂制备的复合菌剂7d对50mg/l对芘的降解率均超过70%，其中500℃生物炭耦合hh1制备的复合菌剂效果最好，可达到90%以上。
[0048]
实施例二：在本实施例中以壳聚糖作耦合辅助剂制备复合型菌剂，其方法如下：将炭基耦合载体700qz与复合菌群hh1按照1:30（w/v）的比例混合，置于摇床中，在37℃、180 r
·
min-1 的条件下振荡 2 h后，加入等体积的6%壳聚糖溶液（用2%盐酸溶液溶解壳聚糖粉末配制6%壳聚糖），混合均匀至粘稠状，逐滴滴入到1mol/l的氢氧化钠溶液中，固化12h后用无菌纱布包裹过滤，并用无菌水反复冲洗，得到的凝胶小球就是复合菌剂，记作700qzpq，其在7d对50mg/l芘的去除率为76.77%，在15d后去除率达到了95.6%。
[0049]
在其它实施例中，我们可以用其它炭基耦合载体与其它复合菌群中hh2等生成相应的复合菌剂。例如，我们使用炭基材料300qz、300lf、300ym、500lf、500qz、500ym、700lf、700ym替代700qz与复合菌群hh1混合，在相同条件下得到相应的复合菌剂300qzpq、300lfpq、300ympq、500lfpq、500qzpq、500ympq、700lfpq和700ympq。
[0050]
图7所示的为上述几种以壳聚糖作辅助剂的复合型菌剂小球，其在7d对50mg/l对芘的降解效果示意图，从图中可以看出，以壳聚糖作辅助剂制备的9种复合菌剂，其在7d对50mg/l对芘的降解率均大于70%，500℃生物炭作耦合载体制备的复合菌剂效果最好，其中500lfpq的降解率最大为86.74%。
[0051]
实施例三：本实施例以吸附耦合的方式制备复合菌剂小球，其方法如下：将9种炭基耦合载体300qz、300lf、300ym、500qz、500lf、500ym、500qz、700lf和700ym与复合菌群hh1按照1:30（w/v）的比例混合，置于摇床中，在37℃、180 r
·
min-1 的条件下振荡 24 h后，使用75μm无菌细胞筛过滤，干燥后得到相应的复合菌剂小球300qzp、300lfp、300ymp、500qzp、500lfp、500ymp、500qzp、700lfp和700ymp。
[0052]
图8所示的为上述9种吸附耦合方式制成的复合型菌剂7d对50mg/l芘的去除效果，可以看出9种复合菌剂的降解率均大于70%，其中500℃与700℃下制备的生物炭作耦合载体制备的复合菌剂效果相对较好，降解率最高可达88.34%为500lfp。
[0053]
下表为实施例一至实施例三，通过海藻酸钠包埋耦合、壳聚糖包埋耦合与吸附耦合制备的炭耦合复合型菌剂（分别称为产品2、产品3和产品1）的性质对比结果：
不同生物炭通过不同耦合方式得到的复合菌剂降解性能的测定：使用无菌的无机盐培养基配制60ml初始浓度为50mg/l的含芘无机盐培养基，而后加入一定量的复合菌剂，其中吸附耦合制备的复合菌剂添加0.5g；海藻酸钠耦合制备的复合菌剂小球添加1g；壳聚糖耦合制备的复合菌剂凝胶球添加1g。将所有处理组置于摇床中，在37℃、180 r
·
min-1 的条件下振荡 7d后取样，测定样品中芘的残留浓度，每个处理组做五个重复，最终去除效果如图9所示，其中海藻酸钠包埋耦合的500ymph去除率最高为95.77%，所有组分的去除率均高于70%。
[0054]
实施例四：将按实施例一～实施例三的制备方法制得的复合型菌剂应用于有重金属胁迫的多环芳烃土壤中进行修复。
[0055]
本实施例主要以500lfph复合型菌剂为例进行说明。
[0056]
土壤收集于东莞理工学院，无污染史，采集0～20cm表层土，将采集到的土壤样品去除植物残体及杂物，自然风干后碾碎并过2mm筛备用。将溶解有芘的丙酮储备溶液缓慢滴入到供试土壤上，边滴边搅拌混匀，然后置于通风橱中，待丙酮完全挥发后，再用剩余的土不断稀释，搅拌混匀，制备得到100mg
·
kg-1
芘污染土壤。然后，取1/2的芘污染土壤，滴入一定量的硝酸镉溶液，不断搅拌混匀，待风干后得到芘和镉（cd）浓度均为100mg
·
kg-1
的污染土样，避光保存，老化2个月备用。
[0057]
将预先配制好的污染土按 200g/盆 装入塑料小盆中，处理组包括：1）复合污染土壤未经任何处理作为空白；2）复合污染土壤添加10%（v/w）游离态菌群 hh1种子液 20ml；3)复合土壤添加5%（w/w）的500lfph 10g。所有处理组每天补加无菌水，使土壤水分控制在 35%左右，置于 25℃培养箱暗处培养45天后采样测定土壤中多环芳烃芘的残留量。
[0058]
经过45d的培养，投加固定化菌群处理组土样中芘的去除率显著高于其他两个处理组。投加游离菌群土样中芘的去除率为19.87%，略微高于空白对照(ck)，由于游离菌群在土壤中处于较弱的竞争能力，表现出较差的稳定性。而500lfph经45d的修复，污染物的去除率可达到85.31%，说明500lfph的稳定性更好，去除芘的能力比较强，降解效果很好。