一种牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂及其应用

1.本发明属于家畜配子胚胎工程技术领域，具体涉及一种牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂及其应用。


背景技术：

2.卵泡颗粒细胞是卵泡中最重要的体细胞，对卵泡局部微环境调节有重要作用。早期颗粒细胞是由卵泡上皮细胞分化而来。颗粒细胞作为重要的类固醇激素合成细胞，可以促进卵巢合成与分泌雌激素和孕激素等多种激素及生长因子，通过缝隙连接调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟，进而调控卵泡发育、成熟、排卵以及卵泡闭锁等过程。
3.奶牛在各种应激状态下，能通过激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，引起肾上腺皮质激素分泌(dobson等，2000)。皮质激素降低lh分泌的脉冲频率，最终使排卵前lh峰无法出现，从而导致排卵失败，诱发卵巢囊肿(dobson等，2006；ribadu等，2000；colitti等，2007；paredes等，2011)。卵巢囊肿是引起奶牛不孕症最常见的原因之一，其严重影响着奶牛的繁殖效率，制约着奶牛场的发展和养殖业的经济效益。据国外研究报道表明，卵巢囊肿的发病率为6.7％～13.1％(wiltbank等，2002)。卵巢囊肿能够降低受胎率，延长产犊间隔，增加配种次数及淘汰率，从而影响奶牛的繁殖力，最终降低奶牛场的经济效益，给奶牛业造成严重的经济损失。
4.外源促肾上腺皮质激素(acth)可诱导奶牛发生卵泡囊肿，其主要通过激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，改变lh分泌的脉冲频率，使排卵前lh峰无法出现而不能排卵，继而形成卵巢囊肿，其机理与应激导致卵巢囊肿一致(amweg等，2013；biran等，2015；velazquez等，2013)。而奶牛卵泡囊肿形成的影响因素较多，其行成是一个涉及多组织、激素及信号通路调控的及其复杂的生物学过程，以前的研究多从卵泡囊肿奶牛血清、卵泡液激素变化及受体基因表达变化展开，虽取得了一些进展，但因生产实践中，当明确为卵泡囊肿时，所进行研究表现出的激素及基因表达变化，在时间上不能完全说明卵泡无法正常排卵时的机体异常变化状态，加上卵泡囊肿形成的不可预知性，造成研究者解析其形成的分子机制有一定困难性。目前，没有有关促肾上腺皮质激素对牛卵泡颗粒细胞影响的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂，用于促进牛卵泡颗粒细胞体外培养合成孕酮。
6.本发明的目的还在于提供促肾上腺皮质激素的一种新的用途，具体为促肾上腺皮质激素用于促进牛卵泡颗粒细胞孕酮的合成中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
8.一种牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂，用于促进牛卵泡颗粒细胞体外培养合成孕酮，其包括含有浓度为10-10
～10-6
mol/l的促肾上腺皮质激素的基础培养液。
9.如上所述的牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂，优选地，所述基础培养液为dmem和
ham’s f-12按体积比为1:1的混合液。
10.如上所述的牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂，所述基础培养液还包括有按体积比的10％的胎牛血清，浓度为100u/ml的青霉素和浓度为0.1mg/ml的链霉素。
11.如上所述的牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂，优选地，促肾上腺皮质激素的浓度为10-7
mol/l。
12.如上所述的牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂，优选地，所述促肾上腺皮质激素是重组鼠源促肾上腺皮质激素蛋白。
13.一种促进牛卵泡颗粒细胞体外分化的培养方法，其是将牛泡颗粒细胞在如上所述的牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂中培养。
14.促肾上腺皮质激素在促进牛卵泡颗粒细胞体外合成类固醇激素中的应用。
15.促肾上腺皮质激素在制备用于促进牛卵泡颗粒细胞体外分化合成药物中的应用。
16.促肾上腺皮质激素在用于促进牛卵泡颗粒细胞体外合成孕酮中的应用。
17.如上所述的应用，优选地，所述促肾上腺皮质激素在牛卵泡颗粒细胞体外培养中所用的浓度为10-10
～10-6
mol/l。
18.进一步，优选地，所述促肾上腺皮质激素在牛卵泡颗粒细胞体外培养中所用的浓度为10-7
mol/l。
19.如上所述的应用，优选地，牛卵泡颗粒细胞体外培养所用的培养基为含有按体积比为1:1的dmem和ham’s f-12培养液为基础培养基，并添加体积比为10％的胎牛血清和浓度为100u/ml的青霉素及浓度为0.1mg/ml的链霉素。
20.本发明的有益效果在于：
21.本发明提供了一种牛卵泡颗粒细胞体外培养调节剂，用于在牛卵泡颗粒细胞进行体外培养时，促肾上腺皮质激素可促进p450scc的表达，抑制p450arom的表达，但对star和3β-hsd表达无影响。促肾上腺皮质激素作为牛卵巢功能的内分泌调控因子，通过上调类固醇激素的合成，进而加速颗粒细胞的分化。
22.本发明提供了促肾上腺皮质激素的一种新的用途，用于促进牛卵泡颗粒细胞体外培养中孕酮的合成。进一步地，将促肾上腺皮质激素应用在牛卵泡颗粒细胞的促进类固醇合成的制剂中，具有良好的应用价值。促肾上腺皮质激素可作为新型的牛卵泡颗粒细胞促进类固醇激素合成药物制剂在家畜胚胎工程上推广应用。
附图说明
23.图1为不同浓度的促肾上腺皮质激素在添加igf1处理时，颗粒细胞孕酮合成情况的比较图。
24.图2为全部加igf1时，在不加和加促肾上腺皮质激素处理时，颗粒细胞p450scc基因的表达结果图。
25.图3为全部加igf1时，在不加和加促肾上腺皮质激素处理时，颗粒细胞p450arom基因的表达结果图。
26.图4为全部加igf1时，在不加和加促肾上腺皮质激素处理时，颗粒细胞star基因的表达结果图。
27.图5为全部加igf1时，在不加和加促肾上腺皮质激素处理时，颗粒细胞3β-hsd基因
的表达结果图。
28.其中，上述图中*表示存在差异(p《0.05)，mol/l简写为m。
具体实施方式
29.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
30.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例中所用卵巢采自河北省大厂县屠宰场，促肾上腺皮质激素由南京莱昂生物科技有限公司合成。所用试剂来源如下：ham’s f-12(f12)、dmem培养基、胎牛血清(fbs)购自gibco(上海)，重组人igf-1购自science 11(san diego，ca)，牛孕酮放射免疫测定(ria)：北京北方生物技术研究所，rna检测试剂：一链合成试剂盒，荧光定量试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)，所用的促肾上腺皮质激素是重组鼠源促肾上腺皮质激素蛋白。
31.实施例1促肾上腺皮质激素对牛卵泡颗粒细胞类固醇激素合成的影响
32.1.细胞培养
33.在屠宰场采集卵巢，置于含有浓度为100iu/ml青霉素和100iu/ml链霉素的0.9％生理盐水中，用保温瓶保持37℃，在2h内运回实验室。使用10ml注射器从屠宰场获取的牛卵巢表面抽取3～8mm卵泡中的液体，要求卵泡血管清晰，卵泡液透明。将卵泡液收集在一个15ml的离心管中，然后用500g离心5min，细胞沉淀于离心管底部，去上清。颗粒细胞分离自直径3～8mm的中等大小的卵泡。用pbs缓冲液重悬细胞，如此离心重复，反复4次。用含有为胎牛血清的10％的dmem培养液重悬细胞，经200目过滤网过滤除去细胞块，获得的颗粒细胞的纯度大于90％。
34.用细胞计数器进行颗粒细胞计数，用5ml含有10％的胎牛血清(10％fbs)的培养液大约铺2
×
105个细胞/ml，置于5％co2，37℃条件下培养箱中静置培养，一般经12h后颗粒细胞即可贴壁，观察细胞贴壁后，更换培养液。每隔24小时更换一次培养液。
35.当细胞增长融合至80％以上时，弃去培养液，之后用pbs漂洗2次。加1ml0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化3min，镜下看到细胞收缩变圆，加1ml含有10％的胎牛血清(10％fbs)的培养液终止消化；收集细胞于离心管中，1500rpm离心5min，收集沉淀用pbs洗涤3次后，收集的细胞用培养液重悬，计数，按1
×
105个细胞/ml接种于12孔培养板上，37℃、5％co2培养箱内培养。
36.其中，上述所用10％fbs的培养液为dmem和ham’s f-12的按体积比为1:1的为基础培养基，添加有体积比为10％的胎牛血清，浓度为100u/ml的青霉素和浓度为0.1mg/ml的链霉素。
37.2.促肾上腺皮质激素对牛卵泡颗粒细胞的处理
38.步骤1获得的颗粒细胞在含体积比为10％fbs的培养液中培养24小时后，弃去培养液，pbs洗涤2次，分别用含有浓度分别为0、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
、10-10
mol/l的促肾上腺皮质激素(acth)的无血清培养液处理48h后。培养结束后，收集培养液用于测定孕酮含量。此实验设计3个不同重复。其中，无血清培养液为dmem和ham’s f-12的按体积比为1:1的混合物，不含有胎牛血清，含添加有浓度为100u/ml的青霉素，浓度为0.1mg/ml的链霉素。
39.3.检测分析
40.采用放射免疫方法进行测定孕酮。
41.孕酮激素分泌水平用spss软件中的单因素因子anova分析。数据用平均数
±
标准误表示。孕酮激素表示为ng/ml。测定结果见图1，结果说明促肾上腺皮质激素提高了颗粒细胞的孕酮合成。
42.实施例2促肾上腺皮质激素对p450scc、p450arom、star、3β-hsd mrna表达的影响
43.1.细胞培养
44.按实施例1中细胞培养的获得颗粒细胞在含体积比为10％fbs的培养液中培养24小时后，弃去培养液，pbs洗涤2次，分别用浓度为0、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
、10-10
mol/l的促肾上腺皮质激素，无血清培养液处理48h培养结束后，收集培养液，细胞裂解后用于rna提取。实验设计3个不同的重复结果取平均值。
45.2.rna提取和rt-pcr定量测定表达量
46.培养结束后，吸取每孔的培养液；在孔中加入0.5ml trizol试剂(天根生化科技有限公司，北京)，并提取rna。rna样品用tecan微孔板检测仪(tecan group ltd.,mannedorf,switzerland)测定260nm处的吸收光度值，rna样品用depc水稀释，保存-80℃。
47.p450scc、p450arom、star和3β-hsd基因引物见已发表文献(hilda m等，2017；thet su等2017)。引物由上海生物工程有限公司合成。每个样品三个重复。持家基因gapdh作为内参基因。采用相对定量法2-△△
ct
公式比较目的基因mrna表达水平。
48.3.检测结果
49.用spss软件中的anova进行基因表达数据分析，数据表示为平均数
±
标准误。
50.结果如图2-5所示，其中细胞色素p450芳香化酶(p450arom)作为p450细胞色素酶超家族中的一员，是类固醇激素生成途径中的关键酶，能够将催化雄激素生物合成雌激素。该基因的调控直接影响到雄激素向雌激素的转化效率。star基因编码类固醇激素急性调节蛋白，可作用于线粒体外膜，介导并促进类固醇的底物—胆固醇经线粒体外膜转运至内膜，然后在胆固醇侧链裂解酶p450scc的作用下转变为孕烯醇酮，其转运出线粒体后进入胞浆，在3β-hsd的作用下转变为孕激素。孕激素合成受到star、p450scc和3β-hsd等的多重调控。
51.结果表明，促肾上腺皮质激素处理牛卵泡颗粒细胞，star和3β-hsd基因表达不发生变化。促肾上腺皮质激素可抑制p450arom基因表达，促进p450scc基因表达(p《0.05)。由此可见，促肾上腺皮质激素能够调控牛卵巢颗粒细胞功能，通过上调类固醇合成相关基因p450scc促进孕酮合成，并通过下调p450arom基因的表达可能抑制雌激素的合成。