利用苏氨酸合成丙酸的方法及其所用重组菌

1.本发明涉及微生物和基因工程领域，具体涉及用苏氨酸合成丙酸的方法及其所用重组菌。


背景技术：

2.恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)是第一个被美国卫生部重组dna委员会(recombinant dna advisory committee，rac)认定为对环境安全的革兰氏阴性细菌(1982年)，并许可kt2440作为基因工程的宿主菌。恶臭假单胞菌kt2440(p.putida kt2440)能够分解环境中的一些有机物，具有生物催化、生物排污等功能，是一种具有极高的工业催化价值的微生物。
3.大肠杆菌作为目前最常见的生物催化宿主之一，已经有多种生物化工产品实现了量产，但利用大肠杆菌生产丙酸并不多见。
4.丙酸及其衍生物在工业上的应用领域十分广泛，主要应用于食品防腐、饲料储藏、医药中间体合成、农业除草剂合成、有机合成中间体等方面。目前主要利用丙酸杆菌厌氧发酵生产丙酸，发酵周期一般在10天以上，副产物，如乙酸、琥珀酸等杂质有机酸较多，存在反应条件苛刻、不宜分离纯化等缺点。降低生产成本，提高转化率是丙酸工业化生产中急需解决的问题。
5.l-苏氨酸是一种必需氨基酸，主要通过微生物发酵的方法制备，目前已经具备成熟的生产工艺，且全球产能面临过剩的风险。综合分析恶臭假单胞菌kt2440的代谢途径，利用l-苏氨酸生产更高附加值的高纯度丙酸，具有更加广阔的市场和价值。在之前的专利中，已经探索了l-苏氨酸作为底物，经过催化生成2-酮丁酸后，在辅酶coa的参与下生成丙酰coa，进一步生成丙酸。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供新的构建途径获得重组菌，所述重组菌可用于催化苏氨酸获得丙酸。
7.为实现上述目的，第一个方面，本发明提供重组菌，所述重组菌表达2-酮异戊酸脱酸酶(也叫酮酸脱羧酶)。
8.所述2-酮异戊酸脱酸酶可选自下述任一种蛋白质：
9.a1)由编码链的编码序列如seq id no.3所示的dna分子编码的蛋白质；
10.a2)将a1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有2-酮异戊酸脱酸酶活性的蛋白质；
11.a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
12.进一步地，上述的重组菌可为将受体菌的基因组进行改造得到的重组菌，所述改造可包括使所述受体菌表达所述2-酮异戊酸脱酸酶，所述受体菌可为假单胞菌或大肠杆菌。
13.进一步地，上述的重组菌，所述使所述受体菌表达2-酮异戊酸脱酸酶可为将所述2-酮异戊酸脱酸酶的编码基因kivd导入受体菌中。
14.所述kivd的可为g1)-g3)中任一项所示：
15.g1)编码链的编码序列如seq id no.3所示；
16.g2)编码链的核苷酸序列如seq id no.3所示；
17.g3)与g1)或g2)具有80％以上的同一性，且编码上述2-酮异戊酸脱酸酶的核苷酸序列。
18.进一步地，上述的重组菌，所述受体菌可为假单胞菌，所述改造可包括：
19.a1)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性；
20.a2)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性；
21.a3)抑制或降低所述假单胞菌基因组中的丙酰辅酶a合成酶的活性；
22.a4)提高或增强所述假单胞菌中的苏氨酸转运酶的活性；
23.a5)提高或增强所述假单胞菌中的苏氨酸脱氨酶的活性。
24.进一步地，上述的重组菌中，a4)中所述苏氨酸转运酶可选自下述任一种蛋白质：
25.b1)由编码链的编码序列如seq id no.1第617-1648位核苷酸所示的dna分子编码的蛋白质；
26.b2)将b1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有苏氨酸转运酶活性的蛋白质；
27.b3)在b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
28.a5)中所述苏氨酸脱氨酶可选自下述任一种蛋白质：
29.c1)由编码链的编码序列如seq id no.2第617-2161位核苷酸所示的dna分子编码的蛋白质；
30.c2)将c1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有苏氨酸脱氨酶活性的蛋白质；
31.c3)在c1)或c2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
32.本发明所述的重组菌中，所述苏氨酸醛缩酶的编码基因为ltae基因，所述甲基柠檬酸合成酶的编码基因为ilva基因，所述丙酰辅酶a合成酶的编码基因为prpe基因，所述苏氨酸转运酶的编码基因为tdcc基因，所述苏氨酸脱氨酶的编码基因为ilva基因。
33.进一步地，上述的重组菌中，所述a1)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性可为将所述假单胞菌基因组中名称为ltae基因的苏氨酸醛缩酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；
34.所述a2)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的甲基柠檬酸合成酶的活性可为将所述假单胞菌基因组中名称为prpc基因的甲基柠檬酸合成酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；
35.所述a3)中，所述抑制或降低所述假单胞菌基因组中的丙酰辅酶a合成酶的活性可为将所述假单胞菌基因组中名称为prpe基因的丙酰辅酶a合成酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；
36.所述a4)中，所述提高或增强假单胞菌中的苏氨酸转运酶的活性可为将名称为tdcc基因的所述苏氨酸转运酶的编码基因及其启动子导入假单胞菌中；
37.所述a5)中，所述提高或增强所述假单胞菌的苏氨酸脱氨酶的活性可为将名称为ilva基因的所述苏氨酸脱氨酶的编码基因及其启动子导入假单胞菌中。
38.进一步地，上述的重组菌，d1)可通过将所述假单胞菌基因组中的所述ltae基因替换为含有所述ilva基因及其启动子的片段实现所述a1)和所述a5)的改造，和/或，d2)可通过将所述假单胞菌基因组中的所述prpc基因替换为含有所述tdcc基因及其启动子的片段实现所述a2)和所述a4)的改造。
39.进一步地，上述的重组菌中，所述tdcc基因可为g4)-g6)中任一项：
40.g4)编码链的编码序列如seq id no.1第617-1648位所示；
41.g5)编码链的核苷酸序列如seq id no.1第617-1648位所示；
42.g6)与g4)或g5)具有80％以上的同一性，且编码上述苏氨酸转运酶的核苷酸序列。
43.进一步地，上述的重组菌中，所述ilva基因可为g7)-g9)中任一项：
44.g7)编码链的编码序列如seq id no.2第617-2161位所示；
45.g8)编码链的核苷酸序列如seq id no.2第617-2161位所示；
46.g9)与g7)或g8)具有80％以上的同一性，且编码上述苏氨酸脱氨酶的核苷酸序列。
47.进一步地，上述的重组菌中，所述tdcc基因及其启动子可为核苷酸序列如seq id no.1第501-1648位所示的dna分子；和/或，所述ilva基因及其启动子可为核苷酸序列如seq id no.2第501-2161位所示的dna分子。
48.进一步地，上述的重组菌中，所述含有所述tdcc基因及其启动子的片段可为核苷酸序列如seq id no.1所示的dna分子；和/或，所述含有所述ilva基因及其启动子的片段可为核苷酸序列如seq id no.2所示的dna分子。
49.本文中，所述恶臭假单胞菌可为恶臭假单胞菌kt2440。
50.本文中，所述苏氨酸醛缩酶可为ltae基因编码的蛋白质，所述苏氨酸醛缩酶基因可为ltae(gene id：1044018,discontinued on 2-apr-2020；基因组：nc_002947.4:c386535-385495)。
51.本文中，所述甲基柠檬酸合成酶可为prpc基因编码的蛋白质，所述prpc基因可为prpc(gene id:1045332,discontinued on 2-apr-2020；基因组：nc_002947.4:c2662848-2663975,20200402)。
52.本文中，所述丙酰辅酶a合成酶可为prpe基因编码的蛋白质，所述prpe基因可为prpe(gene id:1045356,discontinued on 2-apr-2020；基因组nc_002947.4:c2681435-2683324)。
53.进一步地，上述的重组菌中所述受体菌可为大肠杆菌，所述改造可包括：
54.b1)抑制或降低所述大肠杆菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性；
55.b2)抑制或降低所述大肠杆菌基因组中的丙酰辅酶a合成酶的活性；
56.b3)提高或增强所述大肠杆菌中的苏氨酸脱氨酶的活性；
57.b4)提高或增强所述大肠杆菌中的醛脱氢酶的活性。
58.进一步地，b3)中所述苏氨酸脱氨酶选自下述任一种蛋白质：
59.b1)由编码链的编码序列如seq id no.2第617-2161位核苷酸所示的dna分子编码的蛋白质；
60.b2)将b1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)
所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有苏氨酸转运酶活性的蛋白质；
61.b3)在b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
62.b4)中所述醛脱氢酶选自下述任一种蛋白质：
63.e1)由编码链的编码序列如seq id no.4所示的dna分子编码的蛋白质；
64.e2)将e1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与e1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有苏氨酸转运酶活性的蛋白质；
65.e3)在e1)或e2)的n末端或/和c末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
66.进一步地，所述重组菌中，所述b1)中，所述抑制或降低所述大肠杆菌基因组中的苏氨酸醛缩酶的活性可为将所述大肠杆菌基因组中名称为ltae基因苏氨酸醛缩酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；
67.所述b2)中，所述抑制或降低所述大肠杆菌基因组中的丙酰辅酶a合成酶的活性；可为将所述大肠杆菌基因组中的名称为prpe基因的丙酰辅酶a合成酶的编码基因进行基因敲除或者基因沉默；
68.所述b3)中，所述提高或增强所述大肠杆菌基因组中的苏氨酸脱氨酶的活性可为将名称为ilva基因的所述苏氨酸转运酶的编码基因及其启动子导入大肠杆菌中；
69.所述b4)中，所述提高或增强所述大肠杆菌基因组中的醛脱氢酶的活性可为将名称为ppadh基因的所述醛脱氢酶的编码基因导入大肠杆菌中。
70.进一步地，上述的重组菌中，b3)中所述ilva基因可为g7)-g9)中任一项：
71.g7)编码链的编码序列如seq id no.2第617-2161位所示；
72.g8)编码链的核苷酸序列如seq id no.2第617-2161位所示；
73.g9)与g7)或g8)具有80％以上的同一性，且编码上述苏氨酸脱氨酶的核苷酸序列。
74.b4中所述ppadh基因的编码链的编码序列可为g10)-g12)中任一项：
75.g10)编码链的编码序列如seq id no.4所示；
76.g11)编码链的核苷酸序列如seq id no.4所示；
77.g12)与g10)或g11)具有80％以上的同一性，且编码上述醛脱氢酶的核苷酸序列。
78.本文中，所述大肠杆菌可为大肠杆菌mg1655。
79.所述大肠杆菌的苏氨酸醛缩酶可为ltae基因编码的蛋白质，所述ltae基因可为ltae(gene id:944955,updated on 6-may-2021；基因组：nc_000913.3:c909294-908293)。
80.本文中，所述大肠杆菌的丙酰辅酶a合成酶可为prpe基因编码的蛋白质，所述prpe基因可为prpe(gene id:946891,updated on 6-may-2021；基因组：nc_000913.3:c352706-354592)。
81.为实现上述目的，第二个方面，本发明提供制备重组菌的方法，所述制备重组菌的方法可包括m1)或/和m2)：
82.m1)将假单胞菌按照上述方式进行改造，得到重组菌；
83.m2)将大肠杆菌按照上述方式进行改造，得到重组菌。
84.其中，seq id no.3所示的dna分子编码的蛋白质由548个氨基酸残基组成；seq id no.1第617-1648位核苷酸所示的dna分子编码的蛋白质由343个氨基酸残基组成；seq id no.2第617-2161位核苷酸所示的dna分子编码的蛋白质由514个氨基酸残基组成；seq id no.4所示的dna分子编码的蛋白质由497个氨基酸残基组成。
85.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
86.所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag蛋白标签、his蛋白标签、mbp蛋白标签、ha蛋白标签、myc蛋白标签、gst蛋白标签和/或sumo蛋白标签等。
87.表1：标签的序列
88.标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tag ii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl
89.上述重组菌中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
90.上述重组菌中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
91.为实现上述目的，第三个方面，本发明提供上述重组菌在利用苏氨酸生产或制备丙酸中的应用。
92.为实现上述目的，第三个方面，本发明提供制备丙酸的方法，所述方法包括如下步骤：使用上述重组菌催化苏氨酸，得到丙酸。
93.本发明中，重组菌利用苏氨酸转化合成的直接产物为丙酸盐，该丙酸盐可以为丙酸钙、丙酸铵或丙酸钠。
94.丙酸盐可通过反应生成纯的丙酸，也可以丙酸盐的形式直接应用。
95.在含量测定中，丙酸与丙酸盐的含量测定方法相同。
96.本发明中，所述假单胞菌可为恶臭假单胞菌，如恶臭假单胞菌kt2440。
97.本发明中，所述大肠杆菌可为大肠杆菌mg1655。
98.本发明中，所述苏氨酸醛缩酶的作用是催化苏氨酸合成甘氨酸，敲除苏氨酸醛缩酶编码基因ltae的目的是阻断苏氨酸到甘氨酸的途径通路。
99.本发明中，所述甲基柠檬酸合成酶的作用是催化丙酸辅酶a到2-甲基异柠檬酸，敲除甲基柠檬酸合成酶编码基因prpc的目的是阻断丙酸辅酶a到2-甲基异柠檬酸支路途径的降解。
100.本发明中，所述丙酰辅酶a合成酶的作用是催化丙酸到丙酸辅酶a，敲除丙酰辅酶a合成酶编码基因prpe的目的是阻断丙酸到丙酸辅酶a的合成途径。
101.本发明中，所述苏氨酸转运酶的作用是正向调控苏氨酸的跨膜运输，导入苏氨酸
转运酶编码基因tdcc的目的是加强苏氨酸的跨膜向内运输的能力。
102.本发明中，所述苏氨酸转运酶的编码基因来自大肠杆菌。
103.本发明中，所述苏氨酸脱氨酶的作用是酶催化苏氨酸脱水分解生成氨和2-酮丁酸(也叫α-酮丁酸)，导入苏氨酸脱氨酶编码基因ilva的目的是提高菌体催化苏氨酸脱水生成2-酮丁酸的能力。
104.本发明中，所述苏氨酸转运酶的编码基因ilva来自大肠杆菌。
105.本发明中，所述2-酮异戊酸脱酸酶的作用是实现2-酮丁酸脱羧合成丙醛，导入2-酮异戊酸脱酸酶编码基因kivd的目的是提高菌体催化2-酮丁酸脱羧合成丙醛的能力。
106.本发明中，所述2-酮异戊酸脱酸酶编码基因kivd来自乳酸乳球菌。
107.本发明中，所述醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ppadh)的作用是实现丙醛脱氢形成丙酸。
108.本发明中，所述醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ppadh)来源于恶臭假单胞菌。
109.上述的重组菌中，所述ilva基因的启动子可为lac启动子、lacuv5突变、tac启动子、trc启动子中的任一种。
110.上述的重组菌中，所述tdcbc基因的启动子可为lac启动子子、lacuv5突变、tac启动子、trc启动子中的任一种。
111.本发明的有益效果：
112.利用丙酮酸脱羧酶和分支酮酸脱羧酶，将2-酮丁酸催化生成丙醛，反应过程中不需要辅酶coa参与。本发明所述重组菌合成丙酸的途径为2-酮丁酸经2-酮异戊酸脱酸酶催化合成丙酸，提供了丙酸合成的新的代谢途径(如图1和图2)。
113.本发明改造获得的假单胞菌重组菌ps32，催化24小时的苏氨酸合成丙酸的转化率为为96.67％；补料后所述ps32催化苏氨酸合成丙酸的转化率可为98.47％。本发明改造获得的重组大肠杆菌24小时转化400mm的l-苏氨酸为丙酸盐393mm，转化率为98.25％。
附图说明
114.图1为l-苏氨酸合成丙酸(盐)的途径，其中酮酸脱羧酶即为2-酮异戊酸脱酸酶。
115.图2为重组菌的改造示意图。
116.图3为假单胞菌重组菌以苏氨酸为底物合成丙酸的产量。
117.图4为大肠杆菌重组菌以苏氨酸为底物合成丙酸的产量。
具体实施方式
118.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
119.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
120.大肠杆菌s17-1感受态(shanghai weidi biotechnology co.ltd.cat#:dl2010)。
121.质粒pucp18购买于biovector，商品名称为cloning vector pucp18)。
122.表2本专利中所用引物序列表
123.124.125.[0126][0127]
本发明所述重组菌合成丙酸的途径为2-酮丁酸经2-酮异戊酸脱酸酶催化合成丙酸，提供了丙酸合成的新的代谢途径(如图1)。利用丙酮酸脱羧酶和分支酮酸脱羧酶，将2-酮丁酸催化生成丙醛，反应过程中不需要辅酶coa参与。将受体菌按照图2所示的示意图进行改造。
[0128]
实施例1、重组菌ps30的制备
[0129]
1.1、苏氨酸醛缩酶ltae的敲除
[0130]
从恶臭假单胞菌kt2440(atcc 47054)菌株出发，利用同源重组方法敲除了苏氨酸醛缩酶基因ltae(gene id：1044018,discontinued on 2-apr-2020；基因组：nc_002947.4:c386535-385495)，阻断了苏氨酸到甘氨酸的途径通路。苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列如ncbi中wp_010951681.1(2017-5-14)所示。具体步骤如下所述：
[0131]
1.1.1、构建敲除质粒pk18-ltae
[0132]
以pk18质粒(atcc 87097)为模板，用bamhi和hindiii两种限制性内切酶进行切割，得到6022bp的dna线性化片段。
[0133]
选择ltae基因上下游各500bp(seq id no.2第1-500位和seq id no.2第2163-2662位)，设计引物ltae-up-f/ltae-up-r和ltae-down-f/ltae-down-r，以恶臭假单胞菌kt2440的基因组dna为模板，分别用上述引物进行pcr扩增，分别得到500bp上下游敲除同源臂dna片段。
[0134]
用gibson方法(gibson dg,young l,chuang ry,et al.enzymatic assembly of dna molecules up to several hundred kilobases.nat meth,2009,6(5):343
–
345.)将500bp上游敲除同源臂dna片段、500bp下游敲除同源臂dna片段和6022bp的pk18质粒dna线性片段连接到一起，并转化大肠杆菌dh5α(transgen biotech，cd201-01)，用引物pk18-f/pk18-r鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，得到敲除质粒pk18-ltae。
[0135]
1.1.2、利用结合转导技术将质粒pk18-ltae转入kt2440中
[0136]
将质粒pk18-ltae转化到大肠杆菌s17-1感受态细胞中，得到名称为s17-1/pk18-ltae的菌株；
[0137]
将s17-1/pk18-ltae菌株和恶臭假单胞菌kt2240分别接种lb液体培养基，37℃过夜活化。分别取1ml菌液，离心后弃上清，用500μl的lb液体重悬。在无抗性的lb固体培养基上，点10μl的恶臭假单胞菌菌液，晾干。点15μl的s17-1/pk18-ltae菌液覆盖于kt2440之上，晾干。37℃培养12h。
[0138]
1.1.3、两次同源重组
[0139]
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度50微克/毫升庆大霉素和25微克/毫升氯苯酚的lb固体培养基上涂匀，倒置于37℃培养18h，长出的菌落为完成第一次同源重组带有pk18-ltae的菌株。挑单菌落于含有终浓度25微克/毫升氯苯酚和200g/l蔗糖的lb固体培养基上划线，置于37℃培养至长出单菌落，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。用ltae-yz-f/ltae-yz-r引物进行pcr验证，得到1040bp片段的单菌落为完成ltae敲除的菌株，挑选敲除结果为阳性的菌株命名为kt2440δltae。
[0140]
1.2、甲基柠檬酸合成酶基因prpc的敲除
[0141]
从kt2440δltae出发，利用同源重组方法敲除了甲基柠檬酸合成酶基因prpc(gene id:1045332,discontinued on 2-apr-2020；基因组：nc_002947.4:c2662848-2663975)，阻断丙酸辅酶a到2-甲基异柠檬酸支路途径的降解。甲基柠檬酸合成酶的氨基酸序列如ncbi中wp_003250313.1(2019-5-31)所示。具体步骤如下所述：
[0142]
1.2.1、构建敲除质粒pk18-prpc
[0143]
以pk18质粒为模板，用bamhi和hindiii两种限制性内切酶进行切割，得到6022bp的dna线性化片段；
[0144]
选择prpc基因上下游各500bp(seq id no.1第1-500位和seq id no.1第1649-2148位)，设计引物prpc-up-f/prpc-up-r和prpc-down-f/prpc-down-r，以恶臭假单胞菌kt2440的基因组dna为模板，分别用上述引物进行pcr扩增，分别得到500bp上下游敲除同源臂dna片段；
[0145]
用gibson方法将500bp上游敲除同源臂dna片段、500bp下游敲除同源臂dna片段和6022bp的pk18质粒dna线性片段连接到一起，并转化大肠杆菌dh5α(transgen biotech，cd201-01)，用引物pk18-f/pk18-r鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，得到敲除质粒pk18-prpc。
[0146]
1.2.2、利用结合转导技术将质粒pk18-prpc转入kt2440δltae中
[0147]
将质粒pk18-prpc转化到s17-1感受态中，得到s17-1/pk18-prpc的菌株；
[0148]
将s17-1/pk18-prpc菌株和kt2440δltae分别接种lb液体培养基，37℃过夜活化。分别取1ml菌液，离心后弃上清，用500μl的lb液体重悬。在无抗的lb固体培养基上，点10μl的kt2440δltae菌液，晾干。点15μl的s17-1/pk18-prpc菌液覆盖于kt2440δltae之上，晾干。37℃培养12h。
[0149]
1.2.3、两次同源重组
[0150]
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度50微克/毫升庆大霉素和25微克/毫升氯苯酚的lb固体培养基上涂匀，倒置于37℃培养18h，长出的菌落为完成第一次同源重组带有pk18-prpc的菌株。挑单菌落于含有终浓度25微克/毫升氯苯酚和200g/l蔗糖的lb固体培养基上划线，置于37℃培养至长出单菌落，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。用prpc-yz-f/prpc-yz-r引物进行pcr验证，得到1040bp片段的单菌落为完成prpc敲除的菌株，挑选敲除结果为阳性的菌株命名为kt2440δltaeδprpc。
[0151]
1.3、丙酰辅酶a合成酶prpe的敲除
[0152]
从kt2440δltaeδprpc菌株出发，利用同源重组方法敲除了丙酰辅酶a合成酶基因prpe(gene id:1045356,discontinued on 2-apr-2020；基因组nc_002947.4:c2681435-2683324)，阻断了丙酸到丙酸辅酶a的合成途径。丙酰辅酶a合成酶的氨基酸序列如ncbi中wp_010953311.1(2019-7-27)所示。具体步骤如下：
[0153]
1.3.1、构建敲除质粒pk18-prpe
[0154]
以pk18质粒为模板，用bamhi和hindiii两种限制性内切酶进行切割，得到6022bp的dna线性化片段；
[0155]
选择prpe基因上下游各500bp，设计引物prpe-up-f/prpe-up-r和prpe-down-f/prpe-down-r，以恶臭假单胞菌kt2440的基因组dna为模板，分别用上述引物进行pcr扩增，分别得到500bp上游敲除同源臂dna片段和500bp下游敲除同源臂dna片段(核苷酸序列分别如seq id no.5第1-500和501-1000位所示)；
[0156]
用gibson方法将上述500bp上游敲除同源臂dna片段、500bp下游敲除同源臂dna片段和6022bp的pk18质粒dna线性片段连接到一起，并转化大肠杆菌dh5α(transgen biotech，cd201-01)，用引物pk18-f/pk18-r鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，得到敲除质粒pk18-prpe。
[0157]
1.3.2、利用结合转导技术将质粒pk18-prpe转入kt2440δltaeδprpc中
[0158]
将质粒pk18-prpe转化到s17-1感受态中，得到s17-1/pk18-prpe的菌株；
[0159]
将s17-1/pk18-prpe菌株和kt2440δltaeδprpc分别接种lb液体培养基，37℃过夜活化。分别取1ml菌液，离心后弃上清，用500μl的lb液体重悬。在无抗的lb固体培养基上，点10μl的kt2440δltaeδprpc菌液，晾干。点15μl的s17-1/pk18-prpe菌液覆盖于kt2440δltaeδprpc之上，晾干。37℃培养12h。
[0160]
1.3.3、两次同源重组
[0161]
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度50微克/毫升庆大霉素和25微克/毫升氯苯酚的lb固体培养基上涂匀，倒置于37℃培养18h，长出的菌落为完成第一次同源重组带有pk18-prpe的菌株。挑单菌落于含有终浓度25微克/毫升氯苯酚和200g/l蔗糖的lb固体培养
id no.2所示)的单菌落为完成lac-ilva替换的菌株ps30δltae::ilva。
[0176]
2.2、基因组过表达大肠杆菌(escherichia coli)来源的苏氨酸转运酶基因tdcc
[0177]
大肠杆菌(escherichia coli)来源的苏氨酸转运酶氨基酸序列如ncbi中wp_136764442.1(20191013)。制备步骤如下：
[0178]
2.2.1、过表达tdcc质粒的构建
[0179]
从大肠杆菌(atcc 700926)中提取基因组dna，用引物tdcc-f/tdcc-r扩增tdcc基因，得到1332bp的dna片段(编码链的核苷酸序列如seq id no.1第617-1948位所示)。用限制性内切酶bamhi和hindiii对质粒pucp18(biovector，cloning vector pucp18)进行切割，得到5465bp的dna线性化片段。用gibson方法将1332bp的dna片段tdcc和5465bp的pucp18质粒dna线性片段连接到一起，并转化大肠杆菌dh5α(transgen biotech，cd201-01)，用引物pucp18-f/pucp18-r鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，得到过表达质粒pucp18-tdcc。
[0180]
2.2.2、lac启动子和tdcc基因在基因组中的插入整合
[0181]
从ps30δltae::ilva菌株出发，利用同源重组方法将lac启动子和大肠杆菌来源的tdcc基因插入整合到ps30δltae::ilva基因组prpc位点，加强了苏氨酸的转运通路。具体步骤如下：
[0182]
2.2.2.1、构建整合质粒pk18-tdcc::prpc
[0183]
以pk18-prpc质粒为模板，设计引物pk18-prpc-f/pk18-prpc-r进行pcr扩增，得到7022bp的质粒dna线性片段；以质粒pucp18-tdcc为模板，设计引物lac-tdcc-f/lac-tdcc-r进行pcr扩增，得到1448bp大小的dna片段(编码链的核苷酸序列如seq id no.1第501-1948位所示)；用gibson方法将该两种dna片段连接到一起，并转化大肠杆菌dh5α(transgen biotech，cd201-01)，用引物pk18-f/pk18-r鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，得到整合质粒pk18-tdcc::prpc。
[0184]
2.2.2.2、利用结合转导技术将质粒pk18-tdcc::prpc转入出发菌株ps30δltae::ilva中
[0185]
将质粒pk18-tdcc::prpc转化到s17-1感受态中，得到s17-1/pk18-tdcc::prpc菌株。将s17-1/pk18-tdcc::prpc菌株和ps30δltae::ilva分别接种lb液体培养基，37℃过夜活化。分别取1ml菌液，离心后弃上清，用500μl的lb液体重悬。在无抗的lb固体培养基上，点10μl的ps30δltae::ilva菌液，晾干。点15μl的s17-1/pk18-tdcc::prpc菌液覆盖于ps30δltae::ilva之上，晾干。37℃培养12h。
[0186]
2.2.2.3、两次同源重组
[0187]
用涂布棒刮取混合菌落于含有终浓度50微克/毫升庆大霉素和25微克/毫升氯苯酚的lb固体培养基上涂匀，倒置于37℃培养18h，长出的菌落为完成第一次同源重组带有pk18-tdcc::prpc的菌株。挑单菌落于含有终浓度25微克/毫升氯苯酚和200g/l蔗糖的lb固体培养基上划线，置于37℃培养至长出单菌落，这时长出的菌落为完成第二次同源重组的敲除菌株。用prpc-yz-f/prpc-yz-r引物进行pcr验证，得到2488bp片段(编码链的核苷酸序列如seq id no.1所示)的单菌落为完成lac-tdcc替换的菌株ps30δltae::ilvaδprpc::tdcc，记作ps31。
[0188]
实施例3、重组菌ps32的制备
[0189]
3.1、过表达乳酸乳球菌(lactococcus lactis)来源的2-酮异戊酸脱酸酶
[0190]
乳酸乳球菌(lactococcus lactis)来源的2-酮异戊酸脱酸酶(2-ketoisovalerate decarboxylase，kivd)的氨基酸序列如ncbi中wp_012897921.1(20190728)，制备方法如下：
[0191]
从乳酸乳球菌(ncdo 2118)中提取基因组dna，用引物kivd-f/kivd-r扩增kivd基因，得到1647bp的dna片段(编码链的编码序列如seq id no.3所示)。用限制性内切酶bamhi和hindiii对质粒pucp18(biovector，cloning vector pucp18)进行切割，得到5465bp的dna线性化片段。用gibson方法将1647bp的dna片段kivd和5465bp的pucp18质粒dna线性片段连接到一起，并转化大肠杆菌dh5α(transgen biotech，cd201-01)，用引物pucp18-f/pucp18-r鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，得到过表达质粒pucp18-kivd。
[0192]
3.2、制备ps31电转感受态，将质粒pucp18-kivd转入ps31中
[0193]
将重组菌ps31菌株接种lb液体培养基，37℃过夜活化。取100μl活化后菌液转接于10ml的lb培养基中，37℃培养3小时后，离心后弃上清，用5ml的100g/l蔗糖溶液清洗3次，最后用300μl的100g/l蔗糖溶液重悬，电转感受态制作完成，取100μl电转感受态备用。
[0194]
取适量的质粒pucp18-kivd于ps31电转感受态中，2.5kv进行电转，电转后加入1ml的lb培养基，37℃孵育2小时后，在含有终浓度50微克/毫升庆大霉素和25微克/毫升氯苯酚的lb固体培养基上涂匀，37℃培养24小时。长出的单克隆用引物pucp18-f/pucp18-r鉴定，阳性克隆记作ps31/pucp18-kivd，该菌株记作重组菌ps32。
[0195]
实施例4、重组菌ps32全细胞催化生产丙酸
[0196]
4.1、菌体的培养
[0197]
将重组菌ps32接种于lb液体培养基中，37℃过夜活化。取1ml活化后菌液转接于含有终浓度50微克/毫升庆大霉素的100ml的lb液体培养基中，30℃培养24小时后，离心弃上清，得到菌体。
[0198]
4.2、丙酸的全细胞催化生产
[0199]
将步骤1收集得到的菌体用50mm、ph7.0的pbs缓冲液重悬于试管中，od
600nm
值为30，得到菌悬液。向菌悬液中加入l-苏氨酸至其含量为600mm，37℃、150rpm在摇床中反应，8、16、24小时分别取样，10000g离心1min取上清液用0.22μm滤器过滤，得到过滤液，即为待测样品。
[0200]
以丙酸为标准品采用标准曲线法(外标法)利用hplc定量分析待测样品中丙酸的含量。hplc方法：aminex hpx-87h色谱柱(300
×
7.8mm)；二极管阵列检测器(diode array detector，dad)；流动相：6mm硫酸；检测波长：210nm；进样量：10μl；流速：0.5ml/min；柱温：35℃。
[0201]
600mm的l-苏氨酸经过菌株ps32转化8小时可以转化为378mm丙酸铵(丙酸盐)，转化16小时可以转化为530mm丙酸铵(丙酸盐)，转化24小时可以转化为580mm的丙酸铵(丙酸盐)。
[0202]
实施例5、补料工艺提高重组菌ps32全细胞催化生产丙酸的含量
[0203]
5.1、菌体的培养和收集
[0204]
按照实施例4对重组菌ps32进行培养并收集菌体。
[0205]
5.2、补料工艺下丙酸的全细胞催化生产
[0206]
将步骤1收集得到的菌体用50mm、ph7.0的pbs缓冲液重悬于试管中，od
600
值为30。向菌悬液中加入600mm的l-苏氨酸，37℃、150rpm在摇床中反应，22小时后添加250mm的l-苏氨酸和初始量相同的ps32菌体，46、51、58小时分别取样，10000g离心1min取上清液用0.22μm滤器过滤，得到过滤液，即为待测样品。
[0207]
850mm的l-苏氨酸经过菌株ps32 46小时转化反应可转化为778mm丙酸铵(丙酸盐)，经过51小时转化反应可转化为828mm丙酸铵(丙酸盐)，经过58小时转化反应，可以转化为837mm丙酸铵(丙酸盐)。
[0208]
实施例6、大肠杆菌中丙酸合成途径的构建
[0209]
分析大肠杆菌的代谢途径，可以发现其具有完整的由l-苏氨酸经coa参与生成丙酸的途径，这为本发明设计的2-酮丁酸经脱羧酶
‑‑
不需要coa参与生成丙酸奠定了基础。通过敲除支路竞争途径，导入关键酶，使大肠杆菌mg1655能够高效率生成丙酸，且没有其他有机酸生成。
[0210]
采用的crispr-cas敲除方法参考文献“multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system”；下述实施例中的pcas和ptarget质粒构建方法参考文献“multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system.applied environmental microbiology.2015,81(7):2506-2514”。
[0211]
6.1、敲除大肠杆菌苏氨酸醛缩酶ltae
[0212]
以大肠杆菌mg1655为出发菌株，通过同源重组方法敲除苏氨酸醛缩酶ltae(gene id:944955,updated on 6-may-2021；基因组：nc_000913.3:c909294-908293)。
[0213]
将pcas质粒(卡那霉素抗性)导入mg1655(zomanbio，zc1040-2)中，因pcas质粒是温度敏感型质粒，30℃培养15h，筛选得到阳性克隆子mg1655/pcas。
[0214]
以ptarget为模板，ptarget-ltae-f/r为引物，进行pcr扩增，得到2118bp含有ltae基因识别n20的质粒，命名为ptarget-ltae，该质粒中含有ltae基因grna的编码基因，n20的核苷酸序列为cgcggcgaagagtatattgt。
[0215]
以mg1655基因组dna为模板，ltae-up-f/r和ltae-down-f/r引物扩增，分别得到500bp ltae位点上游同源臂和500bp ltae位点下游同源臂；再以上下游同源臂为模板进行overlap pcr，扩增获得1000bp含有ltae基因上下游同源臂的打靶片段(核苷酸序列如seq id no.6所示)。
[0216]
将mg1655/pcas在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-ltae质粒(链霉素抗性)和含有ltae基因上下游同源臂的打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为ltae-up-f和ltae-down-r，得到1000bp的为阳性克隆mg1655/pcas
△
ltae；将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除。得到菌株mg1655/
△
ltae。
[0217]
6.2、敲除丙酰辅酶a合成酶prpe
[0218]
以大肠杆菌mg1655/
△
ltae为出发菌株，通过同源重组方法敲除丙酰辅酶a合成酶prpe(gene id:946891,updated on 6-may-2021；基因组：nc_000913.3:c352706-354592)。
[0219]
以ptarget为模板，ptarget-prpe-f/r为引物，进行pcr扩增，得到2118bp含有prpe
基因识别n20的质粒，命名为ptarget-prpe，该质粒中含有prpe基因grna的编码基因，n20的核苷酸序列为tttacgaaggattgccgacc。
[0220]
以mg1655基因组dna为模板，prpe-up-f/r和prpe-down-f/r引物扩增，分别得到500bp prpe位点上游同源臂和500bp prpe位点下游同源臂；再以上下游同源臂为模板进行overlap pcr，扩增获得1000bp含有prpe基因上下游同源臂的打靶片段(编码链的核苷酸序列如seq id no.7所示)。
[0221]
将mg1655
△
ltae/pcas在30℃培养3h，利用10％(v/v)甘油清洗3次，2.5kv条件下将ptarget-prpe质粒(链霉素抗性)和含有prpe基因上下游同源臂的打靶片段电转入其中，利用卡那霉素和链霉素双抗性筛选，pcr验证获得基因敲除或者插入阳性克隆，引物为prpe-up-f和prpe-down-r，得到1000bp的为阳性克隆mg1655
△
ltae/pcas
△
prpe；将该克隆子在42℃下培养5h，在lb无抗平板上进行划线，将生长出的克隆子在lb无抗和卡那霉素抗性平板上进行对照验证，确认pcas质粒消除。得到菌株mg1655/
△
ltae
△
prpe，记作mg1655
△
2。
[0222]
6.3、过表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶基因ilva、过表达乳酸乳球菌来源的2-酮异戊酸脱酸酶kivd和恶臭假单胞菌来源的醛脱氢酶ppadh
[0223]
大肠杆菌(escherichia coli)来源的苏氨酸脱氨酶ilva的氨基酸序列如ncbi中eev5737228.1(20200406)；乳酸乳球菌(lactococcus lactis)来源的2-酮异戊酸脱酸酶(2-ketoisovalerate decarboxylase，kivd)的氨基酸序列如ncbi中wp_012897921.1(20190728)；恶臭假单胞菌来源的醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ppadh)的氨基酸序列如ncbi中wp_010955785.1，(20160128)
[0224]
从大肠杆菌(atcc 700926)中提取基因组dna，用引物ptrc99a-ilva-f/ptrc99a-ilva-r扩增ilva基因，得到1545bp的dna片段(核苷酸序列如seq id no.2第617-2161位所示)。从乳酸乳球菌(ncdo 2118)中提取基因组dna，用引物ptrc99a-kivd-f/ptrc99a-kivd-r扩增kivd基因，得到1647bp的dna片段(核苷酸序列如seq id no.3所示)。从恶臭假单胞菌kt2440(atcc 47054)中提取基因组，用引物ptrc99a-ppadh-f/ptrc99a-ppadh-r扩增ppadh基因，得到1494bp的dna片段(核苷酸序列如seq id no.4所示)。用限制性内切酶ncoi和hindiii对质粒ptrc99a(biovector，cloning vector ptrc99a)进行切割，得到4120bp的dna线性化片段。用gibson方法将dna片段ilva、kivd、ppadh和ptrc99a质粒dna线性片段连接到一起，并转化大肠杆菌dh5α(transgen biotech，cd201-01)，用引物ptrc99a-f/ptrc99a-r鉴定，挑选目的片段序列正确的阳性克隆提取质粒，得到过表达质粒ptrc99a-ilva-kivd-ppadh。
[0225]
将质粒ptrc99a-ilva-kivd-ppadh转入mg1655
△
2化转感受态细胞中，42℃热激90秒后，冰浴2分钟，加入1ml的lb培养基，37℃孵育1小时后，在含有终浓度100微克/毫升氨苄青霉素的lb固体培养基上涂匀，37℃培养12小时。长出的单克隆用引物ptrc99a-f/ptrc99a-r鉴定，阳性克隆记作mg1655
△
2/ptrc99a-ilva-kivd-ppadh。
[0226]
6.4、重组菌mg1655
△
2/ptrc99a-ilva-kivd-ppadh全细胞催化生产丙酸
[0227]
将重组菌mg1655/ptrc99a-ilva-kivd-ppadh接种于lb液体培养基中，37℃过夜活化。取1ml活化后菌液转接于含有终浓度100微克/毫升氨苄青霉素的100ml的lb液体培养基中，37℃培养2小时后，加入终浓度为1毫摩尔/升iptg，30℃培养16小时后，离心弃上清，得
到菌体。
[0228]
将收集得到的菌体用50mm、ph7.0的pbs缓冲液重悬于试管中，od
600nm
值为30，得到菌悬液。向菌悬液中加入l-苏氨酸至其含量为400mm，37℃、150rpm在摇床中反应，6、12、18、24小时分别取样，10000g离心1min取上清液用0.22μm滤器过滤，得到过滤液，即为待测样品。
[0229]
以丙酸为标准品采用标准曲线法(外标法)利用hplc定量分析待测样品中丙酸的含量。hplc方法：aminex hpx-87h色谱柱(300
×
7.8mm)；二极管阵列检测器(diode array detector，dad)；流动相：6mm硫酸；检测波长：210nm；进样量：10μl；流速：0.5ml/min；柱温：35℃。
[0230]
经过菌株mg1655
△
2/ptrc99a-ilva-kivd-ppadh 46小时转化，将400mm的l-苏氨酸转化为393mm的丙酸铵(丙酸盐)。期间取样结果表明：6小时转化为92mm丙酸铵(丙酸盐)，12小时转化为209mm丙酸铵(丙酸盐)，18小时转化为298mm丙酸铵(丙酸盐)，24小时转化为393mm丙酸铵(丙酸盐)(如图4)。
[0231]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。