一种疏水-静电多功能化的纳米复合胶束的制备及在蛋白质酶保护中的应用

1.本发明属于纳米生物医药材料技术领域。涉及一种纳米粒子表面同时含有疏水以及静电作用力并且两种作用力方便可调的多功能化复合胶束的制备方法，用于提高蛋白质的酶保护效果。


背景技术：

2.蛋白质药物因其特异性强，疗效好等一些优点在生命医学领域发展迅速，已经成为现代生命医药的重要组成部分。但在生命体外，蛋白质在外界严苛环境下(如高温)容易变性，三维结构被破坏，形成不可逆的聚集体，从而失活，丧失其原有的生物活性，对于一些蛋白质药物而言，不仅无效可能还会造成一定的免疫原性等问题。因此开发出有效的策略来提高蛋白质的稳定性十分重要。
3.目前已经有很多方法来保护蛋白，防止其热失活，比如一些小分子添加剂，化学修饰，蛋白质固定化，蛋白质包封和一些功能化的纳米粒子通过表面与蛋白相互作用保护蛋白等，在这些方法中，具有温敏性表面的纳米粒子更具有前景，操作简单，不需要外加别的竞争者，通过温度的变化可实现蛋白质的捕获与释放。但传统的这些温敏性粒子表面性质不能很好的调控，蛋白保护效率较低。


技术实现要素：

4.本发明目的是解决蛋白质的稳定性，特别是温敏性粒子表面性质的调控和蛋白保护效率低下的问题，提供一种疏水-静电多功能化的纳米复合胶束制备方法及在蛋白质酶保护中的应用。
5.本发明通过与蛋白具有不同相互作用(疏水，静电)的材料自组装来制备多功能化的纳米复合胶束，复合胶束的表面性质可以通过控制疏水微区大小、电荷性质、电荷密度精确调控，以此调控材料与蛋白之间相互作用，提高蛋白质保护效果和保护效率。多功能化复合胶束制备方法简单，易于操作。
6.本发明的技术方案
7.一种疏水-静电多功能化的纳米复合胶束，所述多功能化纳米复合胶束是由三种不同的两嵌段共聚物即含有亲水单元的pcl-b-peg、温敏性单元的pcl-b-pnipam和弱聚电解质单元的pcl-b-plys或pcl-b-pglu在水溶液中自组装而成；通过控制三者比例，得到不同表面性质的纳米复合胶束。
8.纳米复合胶束表面的温敏性单元聚异丙基丙烯酰胺(pnipam)，在温度高于其低临界相转变温度-lcst时，pnipam塌缩形成疏水微区，用于结合蛋白，阻止蛋白之间的聚集；温度降低至lcst以下时，pnipam变为亲水伸展状态，释放蛋白，恢复结构；疏水微区的大小通过调节组成单元的含量来精确调控；
9.纳米复合胶束表面的弱聚电解质单元能够通过静电作用吸引带有相反电荷的蛋
白质，排斥带有相同电荷的蛋白，静电作用的强弱通过调节组成单元的含量来调控；
10.纳米复合胶束表面的亲水单元peg不仅可以用来稳定疏水坍缩后的胶束，也用来稳定与蛋白结合后形成的粒子-蛋白复合物，另一方面用来分隔疏水部分形成微区。
11.本发明同时提供了疏水-静电多功能化的纳米复合胶束的制备方法，包括以下步骤：
12.第1、pcl-b-peg的制备
13.聚乙二醇单甲醚(mpeg-oh)与ε-己内酯(ε-caprolactone，以下简称ε-cl)以1:100的物质的量之比溶解在适量重蒸甲苯中，加入一滴催化剂辛酸亚锡(sn(oct)2)，经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，循环三次；在107-113℃条件下反应12-14h，通过冰乙醚沉淀和真空干燥得到pcl-b-peg白色粉末；
14.第2、pcl-b-pnipam的制备
15.第2.1、n-(叔丁氧羰基)乙醇胺与ε-cl以1:100的物质的量之比溶解在适量重蒸甲苯中，加入一滴催化剂辛酸亚锡(sn(oct)2)，经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，循环三次；在107-113℃条件下反应12-14h，得到boc-pcl-oh；
16.第2.2、之后将ddmat(s-1-十二烷基-s
’‑
(α,α
’‑
二甲基-α
”‑
乙酸)三硫代碳酸酯)与(cocl)2(草酰氯)以3:20的物质的量之比溶解在超干二氯甲烷中，反应2-3h后旋蒸除去多余的草酰氯，再加入1当量第2.1步得到的boc-pcl-oh，氮气保护下室温反应22-24h得到大分子链转移剂pcl-cta；
17.第2.3、将pcl-cta与nipam以1:100的物质的量之比溶解在超干1，4-二氧六环中，经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，循环三次，在68-72℃条件下反应22-24h，通过冰乙醚沉淀和真空干燥得到pcl-b-pnipam；
18.第3、pcl-b-plys或者pcl-b-pglu的制备
19.第3.1、将第2.1步中得到的聚合物boc-pcl-oh用无水二氯甲烷溶解，加入适量的三氟乙酸，室温反应3-4h后旋蒸除去多余的溶剂和三氟乙酸，再用无水二氯甲烷溶解，加入适量三乙胺，室温反应3-4h得到pcl-nh2；
20.第3.2、将pcl-nh2与赖氨酸nca以1:10的物质的量之比例加入到无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，28-32℃下反应72-76h后得到pcl-b-plys(z)，将pcl-b-plys(z)用三氟乙酸溶解，再加入适量氢溴酸/乙酸，反应2-3h后冰乙醚沉淀得到pcl-b-plys。
21.或者
22.第3.3、将第3.1步中得到的聚合物pcl-nh2与谷氨酸nca以1:10的物质的量之比加入到无水二氯甲烷中，28-32℃下反应72-76h后得到pcl-b-pglu(z),将pcl-b-pglu(z)用三氟乙酸溶解，再加入氢溴酸/乙酸溶液，反应2-3h后冰乙醚沉淀得到pcl-b-pglu；
23.第4、多功能化复合胶束的制备
24.第4.1正电复合胶束的制备
25.按照一定的质量比将第1步制备的pcl-b-peg，第2步制备的pcl-b-pnipam和第3.2步制备的pcl-b-plys溶解在超干dmf中，三种聚合物在dmf中的浓度均为5mg/ml，三者按照体积比pcl-b-peg:pcl-b-pnipam:pcl-b-plys为15:80:5，30:65:5，45:50:5，混合成1ml溶液，混合均匀，搅拌下逐滴加入到冰的超纯水中，滴速10s/滴，滴加结束后继续搅拌20-30min，转移至截留分子量3500的透析袋中，透析2-3天后得到多功能化的纳米复合胶束。
26.第4.2负电复合胶束的制备
27.将第1步制备的pcl-b-peg，第2步制备的pcl-b-pnipam和第3.3步制备的pcl-b-pglu溶解在超干dmf中，三种聚合物在dmf中的浓度均为5mg/ml，三者按照体积比pcl-b-peg:pcl-b-pnipam:pcl-b-pglu为15:80:5，30:65:5，45:50:5，混合成1ml溶液，混合均匀，搅拌下逐滴加入到冰的超纯水中，滴速10s/滴，滴加结束后继续搅拌20-30min，转移至截留分子量3500的透析袋中，冰水中透析2-3天后得到目标产物纳米复合胶束。
28.本发明还提供了所述疏水-静电多功能化的纳米复合胶束在蛋白质酶保护中的应用。通过优化纳米粒子表面性质，具有静电吸引作用的纳米粒子能够有效结合蛋白，提高蛋白在热压力下的稳定性。多功能化的纳米复合胶束能保护多种蛋白，对于每一种蛋白通过调节三种聚合物的比例来提高保护该蛋白活性的效果。
29.1)正电荷的复合胶束对cab蛋白质保护，将不同比例的正电荷复合胶束与cab蛋白以10:1的质量比混合，50℃下孵育30min，然后置于70℃下30min，4℃冷却后测试蛋白剩余活性。
30.2)负电荷的复合胶束对cab蛋白质保护，将不同比例的负电荷复合胶束与cab蛋白以10:1的质量比混合，50℃下孵育30min，然后置于70℃下30min，4℃冷却后测试蛋白剩余活性。
31.本发明的优点和有益效果：
32.本发明提供了一种疏水以及静电作用多功能化的纳米复合胶束及其制备方法，通过改变温敏性单元pcl-b-pniapm的比例来调控复合胶束表面疏水微区大小，通过引入不同的聚氨基酸链段如聚赖氨酸，聚谷氨酸来改变复合胶束表面所带有的电荷性质，并且通过改变聚氨基酸链段的比例来调节静电作用的强弱，通过这些来调节纳米复合胶束表面与蛋白质的相互作用。多功能化的复合胶束制备过程简单，各作用力精确可调，对于不同蛋白质能够通过改变疏水微区大小和静电作用的强弱来优化出合适结构的纳米粒子，提高蛋白质的酶保护效果。
附图说明
33.图1为本发明中疏水-静电多功能化纳米复合胶束的制备以及在不同温度下与蛋白结合释放过程。
34.图2为制备的多功能化复合胶束的cmc测定图。
35.图3为三组分多功能化纳米复合胶束的zeta电位图，图例中a-b-c-l，a代表pcl-b-peg的含量，b代表pcl-b-pnipam，c代表pcl-b-plys，l代表带正电的聚赖氨酸；a-b-c-h,a代表pcl-b-peg的含量，b代表pcl-b-pnipam，c代表pcl-b-pglu，h代表带负电的聚谷氨酸。
36.图4为pnipam均聚物的lcst测定图谱。
37.图5为多功能化复合胶束对cab蛋白的保护效果。
具体实施方式
38.实施例1
39.一种疏水-静电多功能化的纳米复合胶束制备方法，制备过程如图1所示，该方法步骤及相关评估如下：
40.1)pcl-b-peg的制备
41.称取1g的聚乙二醇单甲醚(mpeg
5k-oh),2.2gε-己内酯(ε-cl)溶解在10ml重蒸甲苯中，加入一滴催化剂辛酸亚锡(sn(oct)2),经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，循环三次；在110℃条件下反应12h，通过冰乙醚沉淀和真空干燥得到pcl-b-peg白色粉末；
42.2)pcl-b-pnipam的制备
43.称取0.1612g n-(叔丁氧羰基)乙醇胺与11.4gε-cl溶解在25ml重蒸甲苯中，加入一滴催化剂辛酸亚锡(sn(oct)2),经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，循环三次；在110℃条件下反应12h，得到boc-pcl-oh；之后称取0.547g ddmat(s-1-十二烷基-s
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(α,α
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二甲基-α
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乙酸)三硫代碳酸酯)用7.5ml重蒸二氯甲烷溶解，量取0.85ml(cocl)2(草酰氯)并用5ml超干二氯甲烷溶解，氮气保护下将其缓慢加入到之前溶解了ddmat的圆底烧瓶中，室温搅拌反应2h，反应完成后旋蒸除去多余的草酰氯和二氯甲烷，为彻底除去草酰氯，往烧瓶里加入10ml重蒸二氯甲烷溶解，旋蒸除去，反复洗涤3次，然后称取5g先前合成的boc-pcl-oh加入到旋蒸完毕的圆底烧瓶中，氮气保护下室温反应24h，反应完成后冰乙醚沉淀，抽滤真空干燥后得到大分子链转移剂pcl-cta；称取0.3gpcl-cta与0.339gnipam加入到茄形瓶中，用5ml重蒸过的1，4-二氧六环溶解，经液氮冷冻-抽真空-解冻过程，循环三次；70℃条件下反应24h，反应完成后冰乙醚沉淀，真空干燥得到pcl-b-pnipam。
44.3)pcl-b-plys的制备
45.称取1g步骤2中得到的聚合物boc-pcl-oh用10ml无水二氯甲烷溶解，加入10ml三氟乙酸，室温反应4h后旋蒸除去多余的溶剂跟三氟乙酸，为彻底除去二氯甲烷跟三氟乙酸，再用10ml无水二氯甲烷溶解，反复洗涤3次，然后加入10ml重蒸二氯甲烷溶解，再加入10ml三乙胺，室温反应4h后冰乙醚沉淀，真空干燥后得到pcl-nh2；称取1gpcl-nh2,0.306g赖氨酸nca加入到10ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，30℃下反应72h后冰乙醚沉淀，真空干燥后得到聚己内酯-b-聚赖氨酸苄酯(pcl-b-plys(z)),称取1gpcl-b-plys(z)用5ml三氟乙酸溶解，冰浴下再加入1ml氢溴酸/乙酸溶液，室温反应2h后冰乙醚沉淀，真空干燥后得到pcl-b-plys。
46.4)pcl-b-pglu的制备
47.称取1g步骤2中得到的聚合物boc-pcl-oh用10ml无水二氯甲烷溶解，加入10ml三氟乙酸，室温反应4h后旋蒸除去多余的溶剂跟三氟乙酸，为彻底除去二氯甲烷跟三氟乙酸，再用10ml无水二氯甲烷溶解，反复洗涤3次，然后加入10ml重蒸二氯甲烷溶解，再加入10ml三乙胺，室温反应4h后冰乙醚沉淀，真空干燥后得到pcl-nh2；称取1gpcl-nh2,0.263g谷氨酸nca加入到10ml无水二氯甲烷中，30℃下反应72h后冰乙醚沉淀，真空干燥后得到聚己内酯-b-聚谷氨酸苄酯(pcl-b-pglu(z)),称取1gpcl-b-pglu(z)用5ml三氟乙酸溶解，冰浴下再加入1ml氢溴酸/乙酸溶液，室温反应2h后冰乙醚沉淀，真空干燥后得到pcl-b-pglu。
48.5)正电不同比例多功能化复合胶束的制备
49.将第1步制备的pcl-b-peg，第2步制备的pcl-b-pnipam和第3步制备的pcl-b-plys溶解在超干dmf中，三种聚合物在dmf中的浓度均为5mg/ml，三者按照体积比pcl-b-peg：pcl-b-pnipam:pcl-b-plys为15：80：5，30：65：5，45：50：5，混合成1ml溶液，混合均匀，搅拌下逐滴加入到7ml冰的超纯水中，滴速10s/滴，滴加结束后继续搅拌20-30min，转移至截留分子量3500左右的透析袋中，冰水中透析2-3天后得到目标产物纳米复合胶束。最后通过称
量将胶束定容到0.5mg/ml。
50.6)负电不同比例多功能化复合胶束的制备
51.将第1步制备的pcl-b-peg，第2步制备的pcl-b-pnipam和第4步制备的pcl-b-pglu溶解在超干dmf中，三种聚合物在dmf中的浓度均为5mg/ml，三者按照体积比pcl-b-peg：pcl-b-pnipam:pcl-b-pglu为15：80：5，30：65：5，45：50：5，混合成1ml溶液，混合均匀。搅拌下逐滴加入到7ml冰的超纯水中，滴速10s/滴，滴加结束后继续搅拌20-30min，转移至截留分子量3500左右的透析袋中，冰水中透析2-3天后得到目标产物纳米复合胶束。最后通过称量将胶束定容到0.5mg/ml。
52.7)三组分多功能化复合胶束的cmc测定
53.利用芘荧光法测定所制备的多功能化的纳米复合胶束的临界胶束浓度，以质量比peg：pnipam:plys＝1:2:1的胶束为模型测定，如图2所示，三组分自组装而成的复合胶束临界胶束浓度依然较低。
54.8)三组分多功能化复合胶束zeta电位的测定
55.利用zeta电位仪测定不同比例三组分多功能化胶束的电位，从图3中可以看出在纳米粒子表面引入聚电解质链段后，材料表面具有一定的电荷，并且引入不同性质的链段，带电性质不同。
56.实施例2：多功能化纳米复合胶束的应用。
57.一种疏水-静电多功能化纳米复合胶束的应用，该方法步骤及相关评估如下：
58.1)温敏性单元pnipam的低临界相转变温度测定(lcst)
59.首先配置pnipam的水溶液为2mg/ml，完全溶解后，逐渐升温，利用紫外分光光度计测定溶液在450nm处的透过率随温度的变化，从图4可以看出，pnipam在温度大于30℃后,透过率降为0，pnipam从溶解伸展变为不溶析出。通过纳米粒子表面温敏性单元pnipam在不同温度下的亲疏水转变来实现胶束与蛋白的可逆结合。
60.2)多功能化复合胶束对蛋白质cab的热保护
61.以胶束与cab蛋白10:1的质量比将其混合均匀，50摄氏度下孵育30min,然后置于70℃高温下30min诱导蛋白失活，冷却30min后测试蛋白活性。将蛋白材料混合液与cab蛋白底物-对硝基苯乙酸甲酯(pnpa)混合均匀，利用紫外分光光度计测定样品在400nm波长处吸光度的变化速率，前60s吸光度随时间变化的斜率代表了cab的活性，通过与同浓度天然cab活性比较，可以得到加入不同材料后蛋白质的剩余相对酶活。从图5可以看出，在纳米复合胶束表面引入与目标蛋白cab带有相同电荷的单元，材料与蛋白相排斥，不能有效保护蛋白。在纳米粒子表面引入相反电荷的单元，材料能够吸引结合蛋白，防止蛋白在高温下聚集失活，而且具有适当疏水微区大小的胶束，疏水pnipam单元比例为65％具有最好的保护效果。