一种奶牛产乳热抗性筛选的SNP分子标记及在育种领域的应用的制作方法

一种奶牛产乳热抗性筛选的snp分子标记及在育种领域的应用
技术领域
1.本发明属于奶牛育种分子标记技术领域，具体涉及一种与奶牛产乳热抗性相关的snp分子标记、检测所述snp分子标记的引物、试剂盒及其在奶牛遗传改良领域的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.奶牛产乳过程中会流失大量的钙离子，在产犊前4周和产犊后4周，奶牛因胎儿骨骼发育和泌乳等原因对钙的需求剧增，极易患产乳热(stevenson and lean,1998)。产乳热(milk fever)，又称生产瘫痪、产后瘫痪、乳热症和临床分娩低钙血症，是一种代谢性疾病。其发生受饲料、环境、分娩季节、管理水平、品种、胎次、产奶量以及发病史等多种因素的影响。产乳热是引发奶牛哺乳期相关的很多关键疾病的风险因素，可以根据血钙浓度将低钙血症分为临床型(血钙浓度《1.4mmol/l)和亚临床型(血钙浓度为1.4-2.0mmol/l)(degaris and lean,2008)。由于奶牛自身很多重要的生理过程都需要钙离子参与，产乳热会对奶牛的健康和生产性能产生严重的不良影响，如乳腺炎、酮症、胎盘滞留、皱胃移位、子宫脱垂等，都与低血钙症有关(erb et al.,1985)。奶牛患亚临床低钙血症的表现不明显，但是非常普遍，据报道，在新西兰牧场中，亚临床低钙血症的患病率为33％，临床低钙血症的患病率为5％(roche,2003)。长期处于亚临床低钙血症状态的奶牛生产年限会缩短3-4年(liang et al.,2017)，更有可能并发其他疾病，且产奶量也会严重降低(wilkens et al.,2020)。在英国，每头患产乳热奶牛的病例对养殖户造成的直接损失约为59英镑(kossaibati and esslemont,1997)。在美国，有学者采用随机模拟模型估算，每头患产乳热奶牛造成的经济损失为246.23美元(liang et al.,2017)。研究奶牛产乳热抗性形成的相关分子基础，对于培育抗产乳热奶牛，减少经济损失具有重要意义。
4.产乳热抗性遗传力为0.6％，属于低遗传力性状(tsiamadis et al.,2016)，很难依赖常规育种方法进行选择。全基因组关联分析(genome-wide association studies,gwas)是探讨动物复杂性状和疾病遗传基础的有力工具(ma et al.,2019,cole et al.,2011,parker gaddis et al.,2018)。国外学者有利用gwas方法鉴定出与奶牛产乳热相关的区域，该区域位于牛6号染色体的10,521,824bp处(freebern et al.,2020)。
5.产乳热是由于血液中钙离子浓度降低导致的严重疾病，维持钙离子稳态对于缓解产乳热具有重要意义。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，camp)水平是调控机体钙离子稳态的重要因素，camp可以参与调节线粒体代谢，是重要的第二信使，camp水平与机体中钙离子稳态密切相关(valsecchi et al.,2017)。而代谢型谷氨酸受体8(glutamate metabotropic receptor 8，grm8)可以通过抑制腺苷酸环化酶活性介导细胞内camp浓度的降低(rose et al.,2008)，进而对机体的钙离子稳态进行调控。grm8位于牛
第4号染色体，与神经发育和谷氨酸代谢通路显著相关，代谢型谷氨酸受体可分为3类，grm8基因是iii类代谢型谷氨酸受体的一员，其编码的mglur8位于谷氨酸突触的突触前网格，是突触前谷氨酸释放的调节因子(zhang et al.,2014)。有研究报道，谷氨酸浓度的持续增加会导致谷氨酸受体过度刺激，诱导钙离子稳态失调，线粒体功能障碍以及神经元坏死或凋亡(khodorov,2004)。钙离子作为细胞内信号转导的重要的第二信使，对神经传递、基因表达和其他生理反应都有一定影响(nanou and catterall,2018)。奶牛患产乳热后致使体内钙离子浓度降低，影响神经和激素调控，进而导致奶牛出现兴奋不安、紧张乱动、体温下降、心跳减弱、瘫痪甚至死亡等(weaver et al.,2016)。grm8基因可能是影响奶牛产乳热抗性的一个候选基因，其遗传变异(snp突变)是导致不同奶牛个体间产乳热抗性产生差异的潜在遗传学基础，但grm8突变与奶牛产乳热关系的研究未见报道。


技术实现要素：

6.基于上述技术背景，本发明目的在于提供一种与奶牛产乳热抗性相关的分子遗传标记，选取有利的单倍型个体留种，从而提高奶牛群体的产乳热抗性，减少经济损失，为育成产乳热抗性高的优良奶牛提供技术支持。基于该技术目的，本发明筛选获得了一种影响奶牛产乳热抗性的grm8基因snp分子标记，该分子标记可应用于筛选优势性状个体，辅助奶牛育种。
7.基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
8.本发明第一方面，提供一种snp分子标记，所述snp分子标记位于牛4号染色体上，具体为以下任意一种或几种的组合：
9.(1)第92074143位，参考碱基为g，变异碱基为a；
10.(2)第92099005位，参考碱基为g，变异碱基为a；
11.(3)第92129674位，参考碱基为g，变异碱基为a；
12.(4)第92141993位，参考碱基为a，变异碱基为g；
13.(5)第92176712位，参考碱基为g，变异碱基为a。
14.本发明筛选种群奶牛产乳热抗性分子标记的方法是：提取来自我国多个地区荷斯坦牛群体的基因组dna，利用牛illlumina bovine 50k snp芯片对奶牛dna样品进行snp分型，获取各地区奶牛群体的snp基因型，并与该群体牛产乳热抗性基因组育种值进行关联分析，探明各基因型与奶牛产乳热抗性高低的关系。基于上述分析，本发明首先鉴定，在牛4号染色体grm8基因的第2、第3内含子上(ncbi:ac_000161.1)上存在与产乳热抗性相关的分子标记snp(bta4:g.92074143g》a,g.92099005g》a,g.92129674g》a,g.92141993a》g,g.92176712g》a)，显著性p值分别为4.87e-07,2.68e-07,7.55e-06,1.58e-03,6.13e-05。其中，bta4:g.92099005g》a与产乳热抗性的相关性最强。
15.进一步的，本发明通过单倍型分析，发现单倍型为gggag是影响牛产乳热抗性的优势单倍型，即该单倍型牛的个体具有较高的产乳热抗性。其中，bta4:g.92099005g》asnp位点与其他位点连锁性较高，可作为该单倍型的标签snp。
16.因此，本发明第一方面优选的技术方案中，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no:4所示，所示序列第164bp处的单核苷酸位点为t或g。
17.本发明第二方面，提供第一方面所述snp分子标记的检测引物。
18.优选的，所述检测引物中，上游引物grm8-f的序列如seq id no.2所示，下游引物grm8-r序列如seq id no.3所示。
19.本发明第三方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述的检测引物。
20.优选的，所述试剂盒中还包括其他检测试剂，所述其他检测试剂为包括但不限于基因组提取试剂、采样工具、pcr扩增试剂、检测芯片、对照品中的一种或多种。
21.本发明第四方面，提供第一方面所述snp分子标记、第二方面所述检测引物和/或第三方面所述试剂盒在奶牛育种领域的应用。
22.上述第四方面优选的方案中，所述奶牛育种领域的应用为产乳热抗性个体的筛选和改善。
23.优选的，所述奶牛为中国荷斯坦奶牛、三河牛、新疆褐牛或草原红牛中的一种。进一步优选的方案中，上述snp分子标记用于鉴定高产乳热抗性的中国荷斯坦奶牛。
24.本发明第五方面，提供一种产乳热抗性奶牛的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：提取待测奶牛的基因组dna，向基因组中加入第二方面所述检测引物进行pcr扩增，通过比对pcr扩增结果，筛选具有高产乳热抗性分子标记的个体进行遗传改良。
25.优选的，所述筛选方法中，如果扩增序列中第164bp处的单核苷酸位点为g，且基因型为gg时，则待测牛属于高产乳热抗性奶牛。
26.以上一个或多个技术方案的有益效果是：
27.1)本发明提供的分子标记(bta4:g.92074143g》a,g.92099005g》a,g.92129674g》a,g.92141993a》g,g.92176712g》a)位于牛4号染色体grm8基因，优势单倍型是gggag单倍型，带有gggag单倍型个体的产乳热抗性优于其他单倍型的个体，可以作为候选基因的分子标记，用于奶牛遗传改良中，辅助选择具有更高产乳热抗性的个体，进而培育出更高产乳热抗性的群体。
28.2)本发明提供的分子标记不受奶牛的年龄和性别限制，可用于奶牛的早期选育，筛选出产乳热抗性高的个体，也可用于对高产乳热抗性奶牛大规模筛选，缩短育种时间，减少养殖成本和隐形的经济损失，推动奶牛产业高质量发展。
附图说明
29.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
30.图1为本发明全基因组关联分析结合fdr校正结果；
31.图2为本发明grm8基因结构示意图及显著snps所在位点；
32.图3为本发明所述高产乳热抗性奶牛和低产乳热抗性奶牛snp单倍型分析以及连锁不平衡分析；
33.其中，图3a为高产乳热抗性群体ld结果，图3b为低产乳热抗性群体ld结果；
34.图4为本发明实施例1的直接测序结果；
35.其中，图4a为grm8参考序列，图4b为野生型，图4c为突变型。
具体实施方式
36.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另
有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
37.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
38.正如背景技术所介绍的，产乳热是威胁奶牛健康状况及产奶量的重要因素，给奶牛养殖企业造成重大的经济损失。为了解决如上的技术问题，本发明设计通过基因型筛选产乳热抗性个体进行遗传性状改良，降低上述疾病的发病率。
39.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
40.实施例1
41.本实施例中，对本发明鉴定与奶牛产乳热抗性相关的分子标记及其应用方式进行详细说明。
42.1.筛选grm8基因作为奶牛产乳热抗性候选基因
43.(1)采集来自我国各地区的11个牧场的2709个荷斯坦牛个体的血液样本。各地区的11个牧场所在地及各牧场血液样品采集数见表2，采用常规方法提取基因组dna，dna样本的od260/280应在1.7-2.1之间，每个样品snp芯片实验需要大于500ng的基因组dna。
44.表1采集样品的牧场所在地点及采集样品数目
[0045][0046]
(2)使用illumina bovinesnp50k芯片对所采集样品的基因型进行测定，经质量控制，共获得47843个常染色体snp标记的基因型。
[0047]
(3)利用参考群体，根据基因型估计每个奶牛个体的产乳热抗性基因组育种值。
[0048]
(4)使用gemma软件对所得基因型数据和产乳热抗性基因组育种值进行全基因组关联分析，分析模型选择一般线性模型，以牛场和牛月龄作为协变量，并基于fdr控制的方法对结果进行多重检验校正。结果表明，显著的snp分别位于牛4号染色体的多个snps(bta4:g.92074143g》a,g.92099005g》a,g.92129674g》a,g.92141993a》g,g.92176712g》a)位点，即定位于grm8基因的第2、第3内含子上，显著性p值分别为4.87e-07,2.68e-07,7.55e-06,1.58e-03,6.13e-05。
[0049]
2.牛grm8基因优势单倍型的鉴定
[0050]
在采集到的2709头荷斯坦牛样品中，剔除检测牛4号染色体显著snps位点检测结果缺失的个体，剩余2698个样品，平均估计基因组育种值为-0.0826，标准差为0.1028，从剩余样本中筛选到估计基因组育种值大于均值加二倍标准差的个体共30个，平均估计基因组育种值为0.2；筛选到估计基因组育种值小于均值减二倍标准差的个体共116个，平均估计基因组育种值为-0.31，使用haploview软件分别对估计基因组育种值较高和较低样本进行连锁不平衡分析，发现一种优势单倍型gggag，其中，bta4:g.92099005g》asnp位点与其他位点连锁性较高，可作为该单倍型的标签snp。
[0051]
3.牛grm8基因snp(bta4:g.92099005g》a)所在区域部分序列扩增
[0052]
(1)牛尾部静脉血液采集
[0053]
选择多个地区的荷斯坦牛作为试验材料，采集牛的尾部静脉血液至含有抗凝剂的真空采血管中；
[0054]
(2)基因组dna提取
[0055]
取牛尾部静脉血200μl，使用苯酚/氯仿抽提法提取血液样品中的dna，dna提取后使用紫外分光光度计对dna的浓度和纯度进行检测，所提取dna浓度应不低于50ng/μl，之后放入-20℃冰箱储存备用；
[0056]
(3)引物设计
[0057]
根据牛grm8基因的基因序列，使用primer premier 5.0设计一对特异引物grm8-f和grm8-r，引物序列如序列seq id 2和序列seq id 3所示；
[0058]
(4)聚合酶链式反应
[0059]
使用上述引物进行pcr扩增，反应体系见表3，扩增条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，参照表3对应退火温度退火30s，72℃延伸30s，30个循环，pcr结束后进行琼脂糖凝胶电泳；
[0060]
表2pcr扩增条件
[0061]
[0062]
通过选择奶牛核心群个体，采用上述分子生物学相关技术对牛4号染色体grm8基因snp的基因型进行检测，选择优势单倍型个体留种，可以改良奶牛群体的产乳热抗性，减少产乳热发病率，降低饲养成本，为培养更优秀的奶牛新品系打下一定基础。
[0063]
实施例2
[0064]
从三个不同地区的中国荷斯坦牛核心群体中分别选取294,268,399个奶牛个体，提取奶牛血液中的dna，使用上述引物进行pcr扩增，之后送往测序公司进行测序，使用danman和seqman等序列分析软件对测序结果进行分析，获取牛4号染色体bta4:g.92099005g》a位点的基因型和等位基因频率，检测结果见表3。检测结果表明，我国荷斯坦牛群体在bta4:g.92099005g》a位点存在3种等位基因型；在所检测的奶牛群体中，gg基因型频率为27.9％，ga基因型组合频率为51.4％，aa基因型组合频率为20.7％。gg基因型为优势基因型，可选取gg基因型个体进行遗传改良，从而培育出抗产乳热的奶牛新品系。
[0065]
表3牛bta4:g.92099005g》a位点基因型在荷斯坦牛群体中的分布结果
[0066][0067]
注：群体1来自甘肃某牧场，群体2来自山东某牧场，群体3来自内蒙古某牧场。
[0068]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。