一种具有抑制胰腺癌细胞系增殖作用的三萜化合物及其制备和应用

1.本发明涉及一种从夏至草中提取分离三萜化合物的方法，并对该三萜化合物对胰腺癌细胞系增殖抑制作用进行研究，以期用于制备抗胰腺癌药物中，属于植物有效成分分离领域和医药领域。


背景技术：

2.夏至草（lagopsis supina (steph) ik. gal.）为唇形科夏至草属多年生草本植物，又名夏枯草、小益母草、假益母草、风车草等，全国各地均有分布。夏至草药用历史悠久，在中医、藏医和蒙医中均有应用。在中医中最早记载于《神农本草经》，以全草入药，临床功用与益母草相似，有些地方作为益母草的代用品使用，主治妇科疾病，如月经不调、产后瘀滞、腹痛、血虚头晕等疾病，几个世纪以来一直被用作治疗肾脏疾病的经验性利尿剂。现代研究表明，夏至草植物中主要含有半日花烷型二萜类、黄酮类、苯乙醇苷类和单萜类成分，其中半日花烷型二萜化合物具有显著的抗肿瘤活性。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种具有抑制胰腺癌细胞系增殖作用的三萜化合物，并对该三萜化合物对胰腺癌细胞系增殖的抑制作用进行研究。
4.本发明的另一目的是提供一种从夏至草中提取分离出所述具有抑制胰腺癌细胞系增殖作用的三萜化合物的方法。
5.一、三萜化合物的提取分离本发明从夏至草中提取分离三萜化合物的制备方法，包括以下步骤：（1）将干燥的中药夏至草全草粉碎，用溶剂浸提，提取液浓缩得到夏至草浓缩提取物。所述溶剂可以选自水、甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷中的一种或两种以上混合溶剂，优选70%乙醇水溶液。所述浸提为室温浸泡提取，每次5~7天，提取3次，合并提取液。所述浸提也可以为加热回流提取，每次1~2小时，提取3次，合并提取液。
6.（2）将夏至草浓缩提取物以0.1~1.0mg/ml溶解在水中，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。
7.（3）石油醚相在200-300目硅胶柱上用石油醚-乙酸乙酯混合液作为洗脱液进行梯度洗脱，依次得到9个组分fr. 1~ fr. 9；组分fr. 7在200-300目硅胶柱上用石油醚-丙酮混合液作为洗脱液进行梯度洗脱，依次得到10个组分fr. 7-1~ fr. 7-10；组分fr. 7-3在megres c18柱上，用水-甲醇混合液为流动相，控制流速为 4~10 ml/min进行洗脱，依次得到化合物1和化合物2。所述石油醚-乙酸乙酯混合液中，石油醚:乙酸乙酯体积比为20:1~1:1；所述石油醚-丙酮混合液中，石油醚:丙酮体积比为10:1~1:1；所述水-甲醇混合液中，甲醇:水体积比为9:1~1:1。
8.所得三萜化合物1、化合物2经红外光谱ir、紫外光谱、氢谱、谱及高分辨质谱表征，
其结构式如下所示：。
9.二、三萜化合物对胰腺癌细胞系增殖的抑制作用1 化合物1和化合物2抑制胰腺癌细胞系的增殖实验方法（cck-8实验）：取对数生长期细胞，接种于96孔板（每孔1
×
104个细胞），待细胞贴壁后，分别加入浓度范围为0.05~50 微摩尔（
µ
m）梯度的化合物1和化合物2，培养72 h，然后每孔加入10微升cck-8溶液继续培养4小时，振荡10分钟，酶标仪450 纳米测定吸光度值，根据吸光值计算细胞存活率和抑制率得到化合物的半数抑制浓度（ic
50
值）。
10.实验结果：采用cck-8法检测化合物对胰腺癌细胞系的增殖抑制作用，化合物1和化合物2的浓度范围为0.05-50微摩尔（
µ
m），作用胰腺癌细胞的时间为72 h。结果如表1所示。通过表1发现，化合物1和化合物2对胰腺癌细胞系都有增殖抑制作用，包括capan-2细胞、cfpac-1细胞、panc-1细胞、sw1990细胞，其中，对capan-2细胞的抑制作用的ic
50
值分别为2.59
ꢀ±ꢀ
0.90和9.42
ꢀ±ꢀ
0.75微摩尔（
µ
m），对cfpac-1细胞的抑制作用的半数抑制浓度（ic
50
值）为1.15
ꢀ±ꢀ
0.12和6.78
ꢀ±ꢀ
0.37微摩尔（
µ
m），对panc-1细胞的抑制作用的半数抑制浓度（ic
50
值）为5.49
ꢀ±ꢀ
0.92和15.28
ꢀ±ꢀ
1.24微摩尔（
µ
m），强于阳性对照紫杉醇（taxol）；对sw1990细胞的抑制作用的半数抑制浓度（ic
50
值）为2.70
ꢀ±ꢀ
0.01和7.84
ꢀ±ꢀ
0.12微摩尔（
µ
m），紫杉醇对sw1990细胞的抑制作用的半数抑制浓度（ic
50
值）为5.32
ꢀ±ꢀ
0.90微摩尔（
µ
m）。上述结果表明，化合物1和化合物2均具有抗胰腺癌活性，活性与紫杉醇活性相当，化合物1的活性比化合物2活性更强。
11.2、化合物1和化合物2抑制cfpac-1细胞微管活性试验方法：取对数生长期cfpac-1细胞，移至预先放置盖玻片的六孔板中，每孔细胞数量为4
×
104个，培养24 小时，分别用摩尔浓度为2.5和5.0微摩尔（
µ
m）的化合物1和化合物2处理细胞， 37℃、5% co2继续培养24小时，弃掉培养液，用4%多聚甲醛固定10分钟，磷
1 608, 1 462, 1 385, 1 265, 1 213, 1 168, 1 082, 1 038 和 889 cm-1
；紫外光谱uv(ch3oh) λ
max (log ε) 202 (0.63), 231 (0.67), 314 (0.03) nm；氢谱1h 和碳谱
13
c nmr 见表2；高分辨质谱hresims m/z 523.341 0 [m + na]
+ (对c
31h48
o5na的计算值, 523.339 4)。
[0016]
化合物2的实验数据如下：无色胶状物；旋光值[α] +25.6 （浓度0.17克/100毫升，溶剂为甲醇），红外光谱ir (膜) ν
max 3 416, 2 957, 1 736, 1 700, 1 607, 1 461, 1 384, 1 267, 1 175, 1 036, 887, 805和 675 cm-1
；紫外光谱uv(ch3oh) λ
max (log ε) 202 (0.68), 233 (0.75), 313 (0.03) nm；氢谱1h 和碳谱
13
c nmr 见表2；高分辨质谱hresims m/z 523.338 1 [m + na]
+ (对c
31h48
o5na的计算值, 523.339 9)。
[0017]
实施例2将实施例1制备的化合物1、化合物2中的至少一种为活性物质，并按药剂学可接受的辅料和规工艺制备成内服制剂，如胶囊剂、片剂、颗粒剂等；或注射剂。