抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用的制作方法

抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒导致的新型冠状病毒肺炎是当前全球关注的公共健康问题。2020年2月11日，这种新型冠状病毒被国际病毒分类委员会命名为sars-cov-2(重症急性呼吸系统综合症冠状病毒2，也称为2019-ncov(2019新型冠状病毒))，同日，世界卫生组织将该病毒所感染的肺炎命名为covid-19。sars-cov-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合症冠状病毒(mers-cov)都是源自动物的人畜共患病原体。尽管冠状病毒通常与人类急性呼吸道感染有关，但其感染多种宿主物种的能力使其成为复杂的病原体。由新型冠状病毒(sars-cov-2)引起的covid-19大流行在世界各地肆虐，并造成数百万住院和死亡。
3.因此，有必要建立快速筛选和检测新型冠状病毒的方法，以对感染者进行隔离或治疗。目前已知的检测方法有实时荧光定量pcr法、血清抗体检测法、抗原检测法等。其中，抗原检测法为通过单克隆抗体检测sars-cov-2的相应抗原靶标，是一种准确、快速、简单和易于使用的诊断方法。而单克隆抗体作为抗原检测法的核心原材料，起着重要作用。


技术实现要素：

4.根据本技术的一个方面，提供了一种抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区。所述重链可变区包括氨基酸序列为seqidno:1所示的cdrh1、氨基酸序列为seqidno:2所示的cdrh2和氨基酸序列为seqidno:3所示的cdrh3。所述轻链可变区包括氨基酸序列为seqidno:4所示的cdrl1、seqidno:5所示的cdrl2和seqidno:6所示的cdrl3。
5.在一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列为seqidno:7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为seqidno:8所示。
6.根据本技术的另一个方面，提供了一种核酸分子。所述核酸分子包括编码权利要求1或2所述的抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体的核苷酸序列。
7.在一些实施例中，编码所述重链可变区的cdrh1、cdrh2和cdrh3的核苷酸序列分别为seqidno:9、seqidno:10和seqidno:11所示，编码所述轻链可变区的cdrl1、cdrl2和cdrl3的核苷酸序列分别为seqidno:12、seqidno:13和seqidno:14所示。
8.在一些实施例中，编码所述重链可变区的核苷酸序列为seqidno:15所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列为seqidno:16所示。
9.根据本技术的再一个方面，提供了上述抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体在制备检测抗新型冠状病毒n蛋白的试剂中的应用。所述抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体用于新型冠状病毒的免疫学检测。
10.根据本技术的再一个方面，提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒。所述试剂盒包括上述抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体。
具体实施方式
[0011][0012]
如本技术和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
[0013]
2019-ncov(sars-cov-2)有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白(spike protein，也称为 s蛋白)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，也称为n蛋白)、膜蛋白(membrane protein，也称为m蛋白)和包膜蛋白(envelope protein，也称为e蛋白)。
[0014]
2019-ncov的核心蛋白是n蛋白。作为病毒核衣壳内最重要的蛋白之一，n蛋白主要负责rna的复制功能。n蛋白与病毒基因组rna相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒 rna的合成过程中发挥着重要的作用。同时，n蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗n蛋白的高水平抗体。
[0015]
因此，本技术以2019-ncov的n蛋白为抗原，制备了相应的单克隆抗体。具体地，运用原核表达的n蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过特异性的高通量筛选得到具有高度特异性的杂交瘤细胞，通过培养和再免疫获得大量小鼠腹水，再经多步分离及纯化获得高效价、高纯度、高灵敏度和高特异性的抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体。本技术的抗新型冠状病毒单克隆抗体可用于elisa、免疫层析、免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，为免疫学检测试剂(例如，检测n蛋白免疫试纸条)提供了所需的原料。以该抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的应用价值。
[0016]
该单克隆抗体可以包括重链可变区和轻链可变区。所述重链可变区包括氨基酸序列为seq id no:1所示的cdrh1、氨基酸序列为seq id no:2所示的cdrh2和氨基酸序列为seq idno:3所示的cdrh3。所述轻链可变区包括氨基酸序列为seq id no:4所示的 cdrl1、seq id no:5所示的cdrl2和seq id no:6所示的cdrl3。
[0017]
重链可变区的氨基酸序列为seq id no:7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列为 seq id no:8所示。
[0018]
本技术还提供了一种核酸分子。该核酸分子可以包括编码上述抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体的核苷酸序列。在一些实施例中，编码重链可变区的cdrh1、cdrh2和 cdrh3的核苷酸序列分别为seq id no:9、seq id no:10和seq id no:11所示。编码所述轻链可变区的cdrl1、cdrl2和cdrl3的核苷酸序列分别为seq id no:12、seq idno:13和seq id no:14所示。在一些实施例中，编码所述重链可变区的核苷酸序列为 seq id no:15所示，以及编码所述重链可变区的核苷酸序列为seq id no:16所示。
[0019]
本技术的抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体可以应用于检测抗新型冠状病毒n蛋白的试剂，例如，检测n蛋白免疫试纸条。在一些实施例中，抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体可以用于新型冠状病毒的免疫学检测，例如，elisa、免疫层析、免疫印迹、免疫荧光等。
[0020]
本技术还提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒。该试剂盒可以包括上述抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体。以该抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体为原料开发的检测试剂盒具备很好的应用价值，具有高的灵敏性和特异性，并且可以早期检测出患有新型冠状病毒的患者。实施例
[0021]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。构建重组质粒
[0022]
取灭活的sars-cov-2毒株(来源于浙江省疾病预防控制中心)，提取病毒的rna，反转录为cdna模板，根据sars-cov-2的n蛋白的序列(genebank登录号:43740575)，利用带有bamh i和ecor i的限制性内切酶位点的引物(正向引物为：ggatccatgtctgataatggaccccaaa(seq id no:17)；反向引物为： gaattcggcctgagttgagtcagcactg(seq id no:18))，pcr扩增1257bp的 sars-cov-2毒株的编码n蛋白的片段。pcr条件为：94℃预变性5分钟，94℃30秒，60℃ 30秒，72℃1分钟，35次循环，72℃延伸10分钟。
[0023]
获得pcr产物后，将pcr产物连接到pmd18t载体(购自takara)，然后通过热击法将连接产物转化dh5a感受态细胞，测序挑选n蛋白的核苷酸序列完全正确的克隆。酶切验证后，测序正确后使用bamh i和ecor i酶切n蛋白的基因片段，将其连入pet28a载体(购自novagen公司)，得到pet28a-np重组质粒。再次进行酶切和测序验证。将酶切和测序验证正确的pet28a-np质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)菌株中诱导表达。制备sars-cov-2的n蛋白
[0024]
将含有pet28a-np的bl21(de3)克隆在含有50μg/ml氨苄和氯霉素的10ml的lb 和0.5％葡萄糖培养基中37℃过夜培养(200rpm)，次日1:100放大转接至500ml的上述培养基中。
[0025]
在37℃和200rpm条件下培养至od600约0.6时加入终浓度为0.5mm的iptg (isopropylβ-d-thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)，16℃诱导16小时后收集菌体。
[0026]
菌体放置在500ml的收菌瓶中，在4000rpm下4℃培养10min后，弃上清。
[0027]
加入15ml的连接缓冲液(20mm的磷酸钠、0.5m的氯化钠、20mm的咪唑，ph7.4)，震荡悬起菌体，置冰上(之后步骤都在冰上进行)，4℃超声破碎(70w，超声90次，每次10s， 10s间歇)至溶液清亮后离心去除沉淀。
[0028]
之后参照ge公司glutathione ni sepharose 6fast flow4b使用指南过柱收集n蛋白，具体操作如下：
[0029]
(1)样品的澄清过滤：使用50ml注射器以及0.22μm滤膜将准备好的细胞悬液上清进行澄清；
[0030]
(2)采用蛋白层析柱，在akta上进行捕获、纯化；
[0031]
(3)进行系统冲洗，再用平衡液冲洗akta的a1泵，洗脱液冲洗b1泵；
[0032]
(4)设置好系统流速0.1ml/min，选择相应的柱位1号位连接蛋白层析柱，用平衡液对 akta及柱子进行平衡，平衡结束后紫外调零；
[0033]
(5)开始上样，将a1泵转移至上样离心管内上样；
[0034]
(6)上样结束后，将a1泵转移至平衡缓冲液中，冲洗平衡液至检测波长稳定后分布洗脱，收集洗脱液；
[0035]
(7)再用平衡液a冲洗，最后冲20％的乙醇，保存。
[0036]
最后，用洗脱缓冲液从柱上洗脱重组6x his标记的n蛋白，用sds-page分析纯化蛋白，考马斯亮蓝染色法观察，最终获得高纯度的sars-cov-2的核衣壳蛋白n蛋白。单克隆抗体mouse anti-sars-cov-2mab4(np-ab)的制备
[0037]
选用6-8周龄且健康的雌性balb/c小鼠，按照预先指定的免疫方案进行免疫注射。上述步骤中获得的n蛋白作为免疫原，免疫balb/c小鼠，提取免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞。通过细胞融合技术将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行融合。经过二轮亚克隆筛选后获得稳定分泌抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而获得抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体。
[0038]
利用前述表达的蛋白，进行动物免疫实验。
[0039]
动物免疫实验具体步骤包括：
[0040]
1、将体重、周龄均值一致的balb/c小鼠随机分为3组(根据上述步骤中获得的免疫抗原n蛋白的剂量分了3组，分别为：a组小鼠中含有的免疫抗原的计量为50ug/只，b组小鼠中含有的免疫抗原的计量为100ug/只，c组小鼠中含有的免疫抗原的计量为150ug/只，每一组小鼠都有对照组)。
[0041]
2、实验开始前，小鼠各收集免疫前血清，通过眼球取血，适量取血，保证小鼠正常状态)作为阴性对照，收集好的血清存于-80℃。
[0042]
3、加铝佐剂(氢氧化铝佐剂)组配制方式：免疫前，每一抗原在75μl pbs中分别稀释至对应剂量(50ug/只，100ug/只，150ug/只小鼠)，并与明矾佐剂(即氢氧化铝佐剂) (1mg/只小鼠)混合，按照体积抗原:佐剂＝3:1(即75ul免疫原稀释液中加入25ul佐剂)；佐剂使用前摇匀，将注射佐剂(25ul)缓慢滴加至免疫原溶液中；佐剂与免疫原稀释液充分混合后，两者充分混合30分钟。使佐剂有效吸附抗原；后续根据免疫动物实验操作进行。
[0043]
4、不加铝佐剂组：抗原在100μl的pbs中分别稀释至对应剂量，即50ug/只，100 ug/只，150ug/只小鼠，免疫原为100μl稀释后的抗原，后续根据免疫动物实验操作进行。
[0044]
5、以2周的间隔皮下注射：实验设计为3次免疫方式，但分别在每一次免疫注射7 天后眼球取血，离心法获得部分小鼠上清，先进行血清抗体滴度检测，最后一次免疫结束7 天后，心脏取血取最大血量，离心获得上清，存于-80℃。2次免疫后的检测数据如下表1所示。表1 2次免疫后血清抗体效价检测数据
[0045]
免疫脾细胞与骨髓瘤细胞系sp2/0细胞融合，通过hat选择培养基(hat选择培养基含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)筛选融合细胞，并对融合细胞进行elisa阳性筛选及亚克隆；筛选出的阳性单克隆，取腹水，用protein a/g抗体纯化柱纯化杂交瘤细胞产生的腹水抗体，纯化后的腹水抗体elisa效价》1:128,000，纯度》90％，该结果通过下步描述的“酶联反应elisa检测识别n蛋白的结合活性”确定。酶联反应elisa检测识别n蛋白的结合活性
[0046]
1、igg抗体滴度检测方式
[0047]
(1)底板包被：将所用抗原用包被稀释液稀释到3ug/ml，每孔各加入配好的包被液 100μl，置4℃冰箱，放置24h。
[0048]
(2)24h后，从冰箱取出后置于37℃平衡30min，之后弃去孔中液体；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
[0049]
(3)封闭酶标反应孔：每孔加入200ul 5％小牛血清后置37℃封闭90min，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
[0050]
(4)加入待检测样品：将样本按照需要的比例进行稀释，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100μl，置于37℃，90min；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
[0051]
(5)加入酶标抗体：按照说明书加入适宜浓度的二抗；37℃，90min之间，每孔加 100μl洗涤同前。
[0052]
(6)加入底物液：底物加入量每孔100μl，置37℃避光放置15～30min。
[0053]
(7)终止反应：每孔加入终止液50μl终止反应，于20min内测定实验结果。检测单克隆抗体mouse anti-sars-cov-2mab4(np-ab)识别n蛋白的结合活性
[0054]
(1)、细胞融合和克隆筛选数据
[0055]
共进行了3轮融合，小鼠编号依次为a1，b2，c0；a1小鼠融合筛选共挑出26个阳性克隆进行亚克隆，最终完全了17个细胞株；经融合筛选，共挑选出160个od450值》2.2 以上的阳性克隆进行倍比稀释检测效价，再进行第二次和第三次亚克隆筛选。得到6个细胞株，分别命名为a1-1到a1-6。b2小鼠融合筛选共挑出76个阳性孔进行亚克隆，经融合筛选，共挑选出120个od450值》2.1以上的阳性孔进行倍比稀释检测效价，再进行第二次和第三次亚克隆筛选，最终完全了4个细胞株，分别命名为b2-1到b2-4。c0小鼠融合未筛选到阳性孔。
[0056]
(2)、腹水制备和检测数据
[0057]
a1小鼠和b2小鼠总共10个杂交瘤细胞株，每个完全细胞株分别打3只f1小鼠，共制备了10个腹水，所有腹水检测效价数据如下表2：表2腹水抗体检测效价数据
和mers-cov-np抗原，对检测新冠病毒具有特异性。对单克隆抗体mouseanti-sars-cov-2mab4(np-ab)的重链可变区及轻链可变区进行序列分析
[0063]
设计扩增单克隆抗体mouseanti-sars-cov-2mab4(np-ab)的重链可变区及轻链可变区基因的引物。
[0064]
取单克隆抗体mouseanti-sars-cov-2mab4(np-ab)对数生长期的杂交瘤细胞株(约107个细胞)，按照trizolrna提取试剂盒的说明书抽提细胞的总rna，以总rna为模板反转录合成cdna第一链，以上述扩增产物为模板pcr扩增抗体的重链可变区和轻链可变区基因。
[0065]
回收单克隆抗体mouseanti-sars-cov-2mab4(np-ab)的重链可变区和轻链可变区基因片段，进行测序。测序结果如下：
[0066]
编码单克隆抗体mouseanti-sars-cov-2mab4(np-ab)的重链可变区的核苷酸序列(345bp)如下：gtgaagctgcaggagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaggatctcctgcaaggcttctggttataccctcacagactattcaatacactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacactgagactgttgagccaacatatacagatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcaaatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcctcaactgggacggaatttgactactggggccagggcaccactctcacagtctcctca(seqidno:15)。
[0067]
编码重链可变区的cdrh1的序列为：ggttataccctcacagactattca(seqidno:9)。
[0068]
编码重链可变区的cdrh2的序列为：ataaacactgagactgttgagcca(seqidno:10)。
[0069]
编码重链可变区的cdrh3的序列为：gcctcaactgggacggaatttgactac(seqidno:11)。
[0070]
重链可变区的氨基酸序列(115aa)如下所示：vklqesgpelkkpgetvrisckasgytltdysihwvkqapgkglkwmgwintetveptytddfkgrfafsletsastaylqinnlknedtatyfcastgtefdywgqgttltvss(seqidno:7)。
[0071]
重链可变区的cdrh1的氨基酸序列为：gytltdys(seqidno:1)。
[0072]
重链可变区的cdrh2的氨基酸序列为：intetvep(seqidno:2)。
[0073]
重链可变区的cdrh3的氨基酸序列为：astgtefdy(seqidno:3)。
[0074]
编码单克隆抗体mouseanti-sars-cov-2mab4(np-ab)的轻链可变区的核苷酸序列(336bp)如下所示：gatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagccttgtacacattactggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(seqidno:16)。
[0075]
编码轻链可变区的cdrl1的序列为：cagagccttgtacacattactggaaacacctatttacattggtac(seqidno:12)。
[0076]
编码轻链可变区的cdrl2的序列为：aaagtttcc(seqidno:13)。
[0077]
编码轻链可变区的cdrl3的序列为：tctcaaagtacacatgttccgctcacg(seqidno:
14)。
[0078]
轻链可变区的氨基酸序列(112aa)如下所示：dvvmtqtplslpvslgdqasiscrssqslvhitgntylhwylqkpgqspklliykvsnrfsg vpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfcsqsthvpltfgagtklelk(seq id no:8)。
[0079]
轻链可变区的cdrl1的氨基酸序列为：qslvhitgnty(seq id no:4)。
[0080]
轻链可变区的cdrl2的氨基酸序列为：kvs(seq id no:5)。
[0081]
轻链可变区的cdrl3的氨基酸序列为：sqsthvplt(seq id no:6)。
[0082]
本技术所披露的一种，带来的有益效果包括但不限于：(1)本技术得到的抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体具有高效价、高纯度、高灵敏度和高特异性；(2)本技术的抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，为免疫学检测试剂(例如，检测n蛋白免疫试纸条)提供了所需的原料。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。
[0083]
本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。