一种不动杆菌及其应用

1.本发明属于微生物领域，特别涉及一种不动杆菌及其应用。


背景技术：

2.当今，因人类活动影响，城市河道及相对开放的水域氨氮指标高居不下。由此引发的生态环境问题已经对人类居家环境和城市形象产生重大影响。传统上，养分主要通过生物处理去除，而生物养分去除过程需要替代厌氧/好氧条件，使得处理系统复杂且耗能。微生物修复水环境成为目前研究的热点领域，目前在针对污水水体氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐的去除也正在随着对硝化细菌，反硝化细菌的研究而逐渐提升到新的层次。
3.生物脱氮主要依靠硝化过程和反硝化过程两个阶段，但参与到这两个过程的微生物生长和处理能力会受到ph,温度，溶解氧，c/n，接种量等各方面的影响。由于温度是影响微生物活性的主要因素，而低温下实现高效稳定的生物脱氮较为困难。据已有的研究表明，反硝化作用适合的温度范围是25℃-35℃，低于25℃反硝化作用会得到抑制。而耐冷菌由于其不同的生理构造、低温下活跃的酶活性及适应性宽泛的温度范围，在环境工程和生物应用等多领域受到广泛研讨和实际应用。在低温下分离和筛选具有耐冷性的脱氮功能菌对于微生物脱氮领域显得意义重大。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种不动杆菌及其应用，填补现有低温微生物脱氮的空白。
5.本发明的一种不动杆菌，不动杆菌(acinetobacter oleivorans)kx-3的保藏编号为cgmcc no.23119，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明的一种所述不动杆菌筛选方法(碱性条件下耐低温同步异养硝化-好氧反硝化微生物菌株的分离方法)，包括：
7.(1)菌株富集：将土壤和无菌水混合，得到悬液，然后将1ml悬液于富集培养基中，10-15℃振荡培养2-3天；
8.(2)将取步骤(1)中的富集培养液，加入反硝化培养基中，10-15℃振荡培养46-50h，得到富集液；
9.(3)取步骤(2)富集液加入反硝化培养基中，10-15℃振荡培养，并测试no
3-的去除效率；重复该步骤直到no
3-的去除效率达到稳定80％以上；
10.(4)取步骤(3)no
3-去除率达到稳定80％以上的悬液进行稀释，10-1
～10-8
涂布在溴百里酚蓝培养基中，于15℃培养直至出现可见的菌株周边变蓝菌落；
11.(5)将上述步骤(4)中长出的变蓝菌落用接种环挑出至固体lb培养基平板上，反复划线3-5次，直到出现单菌落为止。
12.(6)菌株反硝化能力测定：将上述步骤(5)中纯化出的单菌落用无菌接种环挑出至反硝化液体培养基中，于15℃，150r/min振荡，每隔4h测定菌株反硝化能力；
13.(7)菌株硝化能力测定：挑选上述步骤(6)高效脱除no
3-的反硝化菌转入硝化培养基进一步测试nh
4+-n的去除能力。
14.上述步骤的优选方式如下：
15.所述步骤(1)中土壤和无菌水的体积比例为1:9。
16.所述步骤(1)中土壤为取南极拉斯曼丘陵地区的土壤。
17.所述步骤(1)中富集培养基配方为:蛋白胨5.0g，酵母5.0g，nacl 30.0g，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。
18.所述步骤(2)、(3)中反硝化培养基配方为:醋酸钠1.3g，硝酸钾0.722g，磷酸二氢钾0.877g，七水合硫酸镁0.2g,2ml微量元素，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。微量元素：edta 10.0g，硫酸锌0.2g，四水合氯化锰1.2g,七水合硫酸亚铁1.0g,五水合硫酸铜0.5g，六水合氯化钴0.3g，二水合钼酸钠0.2g，氯化钙0.1g，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。
19.所述步骤(1)-(3)中振荡均为130-150r/min。
20.所述步骤(4)中溴百里酚蓝培养基配方为:醋酸钠1.3g，硝酸钾0.722g，磷酸二氢钾0.877g，七水合硫酸镁0.2g，微量元素2ml，琼脂20g，1％溴百里酚蓝1ml ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。
21.所述步骤(7)中硝化培养基配方为:醋酸钠1.3g，氯化铵0.382g，磷酸二氢钾0.877g，七水合硫酸镁0.2g，微量元素2ml，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。
22.本发明的一种所述不动杆菌在低温下生物脱氮中的应用。
23.本发明的不动杆菌(acinetobacter oleivorans)kx-3，已于2021年8月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23119。
24.有益效果
25.(1)本发明通过选择南极第36次科考站点拉斯曼丘陵地区土壤作为菌种来源，配合合适的培养基，先后通过好氧菌种富集、好氧初筛、获得了耐低温同步异养硝化-好氧反硝化菌，同一种菌种在低温下具有良好的脱氮效果，解决了传统的硝化-反硝化菌在低温下效果变差的弊端。
26.本发明对耐低温同步异养硝化-好氧反硝化菌富集驯化方法简单，操作容易，驯化周期短，筛选效率明显提升。
27.(2)本发明驯化出的耐低温同步异养硝化-好氧反硝化菌能够直接以no3-或nh4+为电子受体高效脱氮，对no3
‑‑
n和nh4+-n的去除率达到67.2％和76.7％，相比于传统脱氮除磷工艺，极大的提高了低温下微生物的耐受性，具有较大的经济效益和环境效益。
28.(3)本发明选择从南极第36次科考站点拉斯曼丘陵地区土壤作为菌种来源，配合合适的培养基，先后通过好氧菌种富集、驯化、初筛、培养获得了同时具有良好脱氮效果的同步异养硝化-好氧反硝化菌，该菌为acinetobacter oleivorans cgmcc no.23119，在碱性条件下具有良好的低温脱氮效果。
附图说明
29.图1为kx-3菌株的扫描电镜图。
30.图2为不同温度下48h菌株kx-3对nh
4+-n与no
3-‑
n的去除效果。
31.图3为不同ph下48h菌株kx-3对nh
4+-n与no
3-‑
n的去除效果。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
33.实施例1
34.菌株的富集与分离
35.(1)菌种来源：土壤样品来自于中国南极第36次科学考察采回的拉斯曼丘陵地区土壤。将土壤样品与无菌水按体积比1：9的比例放入250ml锥形瓶中，在15℃，120r/min，振荡1h,使土壤与无菌水均匀分布。
36.(2)配置富集培养基：蛋白胨5.0g，酵母5.0g，nacl 30.0g，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。
37.(3)将(1)中与无菌水混合后的土壤悬液取5ml加入到100ml灭菌后的富集培养基中，于15℃，150r/min，振荡48h。
38.(4)耐低温好氧反硝化菌驯化：配置反硝化培养基：醋酸钠1.3g，硝酸钾0.722g，磷酸二氢钾0.877g，七水合硫酸镁0.2g,2ml微量元素，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。微量元素：edta10.0g，硫酸锌0.2g，四水合氯化锰1.2g,七水合硫酸亚铁1.0g,五水合硫酸铜0.5g，六水合氯化钴0.3g，二水合钼酸钠0.2g，氯化钙0.1g，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。取上述(3)中富集液10ml加入100ml灭菌后的反硝化培养基中，于15℃，150r/min，振荡48h。随后取10ml上述悬液加入到新鲜的灭菌后的反硝化培养基中。再次于15℃，150r/min，振荡48h。并于反应结束时用分光光度计法测量no3-‑
n的去除效果。重复上述操作，直到no3-‑
n的去除效果达到稳定80％以上。
39.(5)耐低温好氧反硝化菌初筛：配置溴百里酚蓝培养基：醋酸钠1.3g，硝酸钾0.722g，磷酸二氢钾0.877g，七水合硫酸镁0.2g，微量元素2ml，琼脂20g，1％溴百里酚蓝1ml ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。121℃高压灭菌后，制作成固体平板。取最后一个周期的液体驯化培养基1ml，按10倍稀释法将菌液稀释成10-1
—10-8
梯度的菌悬液，取0.1ml涂布于含溴百里酚蓝的反硝化固体培养基上，用无菌涂布器涂布均匀。置于15℃的生化培养箱中培养直至长出清晰的菌落。挑选溴百里酚蓝培养基由黄色变为蓝色的单菌落，继续在溴百里酚蓝固体培养基上划线纯化，如此重复3-5次，直至分离出现单菌落。把各个单菌分别命名为a菌，b菌，c菌等。这是初步得到具有反硝化能力的菌株。
40.(6)耐低温好氧反硝化菌复筛：将上述(5)初筛中得到的具有反硝化能力的菌株用无菌接种环进行转移至100ml灭菌后的反硝化培养基中，每隔4h取样用分光光度计法测定no3-‑
n的去除效果。得到高效的好氧反硝化能力菌株。
41.(7)菌株硝化能力测定：将上述(6)中得到的高效好氧反硝化菌株接种至异养硝化培养基中。异养硝化培养基：醋酸钠1.3g，氯化铵0.382g，磷酸二氢钾0.877g，七水合硫酸镁0.2g，微量元素2ml，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。于15℃，150r/min，振荡。每隔4h用纳氏试剂分光光度法测量nh
4+-n的去除效果。
42.(8)菌株保藏：制备纯化保藏培养基:蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，nacl 1.0g，20g琼脂，ph 7.0-7.2，蒸馏水1l。121℃灭菌30min。经过划线分离培养，得到一株编号为kx-3的
同步异养硝化-好氧反硝化细菌。将其在平板划线纯化，用50％甘油在-80℃冰箱中保藏备用。
43.(9)菌种的鉴定
44.参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行。
45.菌落形态特征：不动杆菌(acinetobacteroleivorans)kx-3的菌落为圆形，边缘整齐，白色，光滑。
46.16s rdna序列测定：
47.16s rdna序列测定由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。takaralysis buffer for microorganism to direct pcr(code no.9164)中变性后离心取上清作为模板，反应条件80℃，15min；使用takara 16s rdna bacterial identification pcr kit(code no.rr176)进行pcr扩增目的片段。pcr反应体系(50μl):模板dna1μl，pcr premix 25μl，forward primer(20pmol/ul)0.5μl，reverse primer2(20pmol/ul)0.5μl，16s-free h2o 23μl。pcr反应条件:94℃5min；30次循环:94℃1min，55℃1min,72℃1.5min；72℃5min；使用takara minibestagarose gel dna extraction kit ver.4.0(code no.9762)切胶回收目的片段；以seq forward、seq internal和seq reverse为引物进行dna测序。测序后，得到菌株16srdna序列，如seq id no.1所示。
48.实施例2
49.用以下实验验证本发明的有益效果。
50.不同温度下菌株同步异养硝化-好氧反硝化效果步骤如下：
51.(1)配置以no
3-‑
n和nh
4+-n为氮源的模拟污水:称取0.288gkno3与0.153g nh4cl)，0.615g ch3coona、0.439gkh2po4、0.20gmgso4·
7h2o、2ml微量元素溶于1l去离子水中，分别取100ml配置好的溶液于150ml锥形瓶中。
52.(2)分别取0.5ml处于对数期(od600≥0.8)的富集培养基悬浮液接种到上述锥形瓶中，在15，25，30，35，40℃条件下于水浴恒温振荡器中培养，每隔4h监测no
3-‑
n与nh
4+-n含量。
53.如图2所示是48h时菌株kx-3在不同温度下对no
3-‑
n和nh
4+-n的同步去除情况:由图2可知，no3-‑
n和nh
4+-n去除率随着温度的升高逐步降低，no3-‑
n和nh
4+-n均在15℃时达到最高，分别为62.35％和70.6％。
54.不同ph下菌株同步异养硝化-好氧反硝化效果步骤如下：
55.(1)配置以no
3-‑
n和nh4
+-n为氮源的模拟污水:称取0.288g kno3与0.153g nh4cl)，0.615g ch3coona、0.439g kh2po4、0.20g mgso4·
7h2o、2ml微量元素溶于1l去离子水中，分别取100ml配置好的溶液于150ml锥形瓶中。
56.(2)分别取0.5ml处于对数期(od600≥0.8)的富集培养基悬浮液接种到上述锥形瓶中，在15℃条件下，设置不同溶液ph＝5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0于水浴恒温振荡器中培养，每隔4h监测no
3-‑
n与nh4
+-n含量。
57.如图3所示是48h时菌株kx-3在不同ph下对no
3-‑
n和nh
4+-n的同步去除情况:由图3可知，no3-‑
n和nh
4+-n去除率随着ph的升高逐步增大no
3-‑
n去除效率在ph为10时达到最高65.20％。nh
4+-n在ph为11时达到最高75.3％。这表现出菌株kx-3在碱性条件下同步脱氮的良好效果。
58.对比例1
59.以松江污水处理厂二沉池污泥为菌种来源，经过与本案例相同的过程和方法，筛选得到的菌种，反硝化效果也较好，达到80％左右。但是最佳反应温度为30℃。不及菌株kx-3在低温下依然有良好的反硝化效果。这可能是由于松江污水厂中微生物运行温度大多为中温，没有低温的环境使菌株适应。而菌株kx-3的样品来源是南极高寒地带，微生物对低温的适应性更强。