一种非天然茶碱RNA分子开关

一种非天然茶碱rna分子开关
技术领域
1.本发明涉及一种非天然茶碱rna分子开关，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.基因调控在蛋白质表达工程、代谢工程以及合成生物学领域当中多有应用，目前基因调控主要基于诱导型启动子、转录因子等进行。近年，发现了一类在细菌中存在的rna调控元件——核糖开关。核糖开关是一类首先在细菌5’非编码区发现的rna元件，结构简单，由适体域和表达平台域组成，可在转录翻译过程中直接感知特异小分子浓度等变化来进行高效、准确的调控。因其调控过程中不需要蛋白因子的参与等优点逐渐引起研究人员的兴趣。
3.核糖开关由一个可以响应高亲和力配体的适体域(aptamer)和表达平台域组成；通过利用适体域区域固有的三级结构来识别特异性的配体并结合配体，能够感知配体的浓度。核糖开关在转录水平和翻译水平均可实现调控，转录水平的调控是通过在表达平台域形成终止子或者抗终止子影响rna聚合酶的功能，从而引起转录的终止或激活；翻译水平的调控通过配体和适体域的结合改变茎环结构，从而暴露或者隐藏sd序列，激活或终止翻译的进行。核糖开关现已在大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等其他菌株中作为调控元件调控外源基因的表达。
4.天然核糖开关的适体域往往序列冗长，形成的二级结构和高级结构较复杂，需要利用基因工程手段来简化序列构成，以促进在构建诱导型基因表达系统中的应用。然而，这种通过压缩序列简化天然核糖开关序列的策略往往导致核糖开关功能降低，甚至失能。为了解决这种问题，最近研究者利用体外selex的方法筛选出了能够结合茶碱的人工rna适配体。这种适配体具有序列较短，结构简单，与茶碱配体结合能力强等特点。随后，这种适配体迅速被用于多种核糖开关的设计和构建中，包括了在转录水平和翻译水平的多种人工核糖开关，并应用于重组蛋白表达和代谢工程领域。然而，现有的核糖开关无论是在转录水平还是翻译水平发挥功能，均出现本底渗漏高、诱导水平低的问题，导致整体诱导率不高。而诱导率又是评价诱导型基因表达系统作用严谨性的重要指标。因此，提供一种更加严谨、作用水平更高的人工核糖开关对于蛋白质表达工程领域、代谢工程领域以及合成生物学领域有重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一种rna分子开关，核苷酸序列如seq id no.3所示。
6.本发明的第二个目的是提供一种调控元件，所述调控元件组合包括所述rna分子开关和启动子；其中，rna分子开关位于启动子转录起始位点下游。
7.在一种实施方式中，所述启动子包括p43、p
veg
、p
spovg
、p
ylbp
和p
glpd
。
8.在一种实施方式中，所述启动子p43的核苷酸序列如seq id no.4所示，启动子p
ylbp
的核苷酸序列如seq id no.5所示，启动子p
veg
的核苷酸序列如seq id no.6所示，启动
子p
spovg
的核苷酸序列如seq id no.7所示，启动子p
glpd
的核苷酸序列如seq id no.8所示。
9.本发明的第三个目的是提供一种载体，所述载体携带所述rna分子开关或调控元件。
10.在一种实施方式中，所述茶碱核糖开关位于载体启动子转录起始位点下游。
11.在一种实施方式中，所述载体包括载体pbp43-gfp。
12.本发明的第四个目的是提供一种蛋白表达系统，所述系统携带所述调控元件或所述载体。
13.在一种实施方式中，所述蛋白表达系统以枯草芽孢杆菌为宿主。
14.在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌b.subtilis 168。
15.本发明的第五个目的是提供一种调控目的蛋白表达的方法，所述方法为在所述调控元件下游连接目的基因后构建至载体，在细胞中表达；通过在细胞培养过程中添加茶碱，调控目的蛋白表达。
16.在一种实施方式中，添加终浓度为2-10mm的茶碱溶液。
17.在一种实施方式中，目的基因包括酶。
18.在一种实施方式中，枯草芽孢杆菌包括bacillus subtilis 168、bacillus subtilis wb800或bacillus subtilis pwb980。
19.本发明还提供上述方法在制备目的蛋白中的应用。
20.本发明还提供上述方法在食品、化工或制药领域的应用。
21.本发明还提供上述rna分子开关、上述调控元件、上述载体或上述蛋白表达系统在制备目的蛋白中的应用。
22.本发明还提供上述rna分子开关、上述调控元件、上述载体或上述蛋白表达系统在食品、化工或制药领域的应用。
23.本发明的有益效果：
24.本发明通过设计随机序列获得一系列非天然茶碱核糖开关，以绿色荧光蛋白基因为目的基因，通过对本底荧光强度/od600、诱导后荧光强度/od600和诱导率三个指标综合评价筛选，得到了一种可调控外源蛋白表达的茶碱核糖开关2nt。当茶碱核糖开关2nt与启动子p43组合时，诱导水平高与不含有茶碱核糖开关的表达水平相近，诱导率达到6.5倍；与启动子p
glpd
组合时，诱导率达到4.5倍；与启动子p
veg
、p
spovg
或p
ylbp
组合时，几乎没有本底荧光的表达。当以天冬氨酶和β-葡糖醛酸苷酶基因为目的基因时，加入4mm茶碱溶液，可以使两种酶均成功受诱导而表达，酶活达到23.6u/ml、124.5u/ml。该过程中不需要其他蛋白因子的参与，并且能够有效快速地实现基因调控。
附图说明
25.图1：茶碱核糖开关随机序列设计示意图。
26.图2：茶碱核糖开关的筛选。根据本底荧光强度/od600、诱导后荧光强度/od600和诱导率三个指标综合评价筛选茶碱核糖开关。
27.图3：茶碱核糖开关2nt与启动子组合验证。p43,pylbp,pveg,pspovg与pglpd启动子分别与2nt组合，在有茶碱和无茶碱诱导下gfp表达的荧光强度。
28.图4：sds-page蛋白电泳图。检测pylbp,pveg,pspovg与pglpd启动子分别与2nt组
合后，在有4mm茶碱和无茶碱诱导下gfp蛋白质表达水平。
29.图5：天冬氨酸酶(aspa)和β-葡糖醛酸苷蛋白质表达水平。
30.图6：天冬氨酸酶和β-葡萄糖苷酸酶的酶活测定。
具体实施方式
31.(一)培养基
32.lb培养基(g
·
l-1
)：胰蛋白胨(tryptone)10；酵母提取物(yeast extract)5；氯化钠(nacl)10。
33.spi培养基(g
·
l-1
)：0.2％(nh4)2so4,1.4％k2hpo4,0.6％kh2po4,0.02％mgso4·
7h2o,0.1％柠檬酸钠，0.5％葡萄糖，1
×
caye。
34.spii培养基(g
·
l-1
)：spⅰ培养基加入1％体积50mmol/l cacl2溶液，1％体积250mmol/l mgcl2溶液
35.(二)枯草芽孢杆菌168转化方法
36.感受态的制备：挑枯草芽孢杆菌168单菌落接种至2ml的spi培养基中，37℃摇床培养12-14h；从培养物中取100μl，接种至5ml spi培养基中，37℃摇床培养4-5h后开始测od
600
。当od
600
约为1.0时，移取200μl菌液转接至2ml的spii培养基中，于37℃、100r
·
min-1
摇床孵育1.5h；向管中加入20μl l00
×
egta(乙二醇双(α-氨基乙基醚)四乙酸)溶液，于37℃、100r
·
min-1
摇床中培养10min后分装500μl每l.5ml离心管；
37.质粒转化：向管中加入经过测序验证正确的适量质粒，吹吸混匀放置于37℃、100r
·
min-1
的摇床中培养2h；培养结束，吸取菌液约200μl均匀涂相应的选择性平板，37℃培养12-14h。
38.(三)绿色荧光蛋白gfp荧光检测
39.绿色荧光蛋白gfp荧光检测样品12000g离心5min，收集菌体，pbs缓冲液洗3次，用pbs稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μl至96孔酶标板，放入synergy tm h4荧光酶标仪检测荧光。程序设置为：600nm检测菌体浓度；激发光495nm，发射光525nm，增益100，检测荧光强度。
40.(四)含有茶碱核糖体随机序列文库的构建方法
41.合成含有seq id no.2序列的引物n2nt-f和n-2nt-r，已pbp43-gfp质粒为模板，通过反向扩增的方式将其插入至p43启动子转录起始位点下游。将pcr产物转化b.subtilis 168菌株后，形成随机序列文库。
42.(五)sds-page检测方法
43.sds-page检测：将培养基中的培养液取出1ml，12000r
·
min-1离心2min，收集菌体，用1
×
pbs缓冲液清洗3次，再加入含有1mg
·
ml-1溶菌酶的te缓冲液悬浮，于37℃温浴2h。然后进行超声破碎，工作时长3s，间歇时间2s，直至菌悬液澄清透明。12000r
·
min-1离心20min，取200μl上清，然后加入50μl的5
×
loadingbuffer，沸水浴10min，上样检测。
44.(六)下述实施例中涉及的质粒：
45.pbp43-gfp：已公开于文章，且在该文章中的名称为pbp43gfp：缪胜男.自裂解型人工适体核酶的设计及其在枯草芽胞杆菌基因表达中的应用[d].江南大学,2019.
[0046]
实施例1：人工茶碱核糖开关的基因序列的设计和文库筛选
[0047]
(1)茶碱核糖开关随机序列的设计：根据茶碱适配体的序列seq id no.1来定义目的核糖开关的结构特征，与茶碱适体域配形成配对结构的下游序列设置为10nt，在3’末端设置了8nt的u-tract，并预设2-nt长度(序列为tt)的通讯模块(cm)来连接适体域和终止子，如图1所示。
[0048]
(2)核糖开关突变体文库的构建：以pbp43-gfp为模板，将含有步骤(1)中的茶碱核糖开关随机序列(seq id no.2)的n2nt-f和n-2nt-r为引物(表1)，通过反向扩增的方式将茶碱核糖开关随机序列插入至p43启动子转录起始位点下游，利用dpn i dna消化酶消化pcr产物2h后进行纯化，回收产物并转入大肠杆菌e.coli jm109，涂布固体lb平板，37℃过夜培养。收集平板上所有菌落，提取总质粒，转化入枯草芽孢杆菌b.subtilis 168，构建出核糖开关突变体文库。
[0049]
(3)茶碱核糖开关的筛选：将步骤(2)中的核糖开关突变体文库涂布固体lb培养基，37℃过夜培养，挑取不同单菌落于含有500μl lb培养基的96深孔板中37℃培养5h，将96深孔板的菌液平均分到实验组96深孔板和对照组96深孔板，在实验组的96深孔板中添加终浓度4mm的茶碱，对照组加入等体积的dmso，37℃培养24h，取样，使用酶标仪检测od600和gfp表达。以对照组得到的gfp表达为本底荧光强度，以实验组测定的gfp表达为诱导后荧光强度，以诱导后荧光强度/本底荧光强度为诱导率，根据本底荧光强度/od600、诱导后荧光强度/od600和诱导率三个指标综合评价筛选茶碱核糖开关。筛选结果如图2所示，其中b18诱导表达水平高，但其本底过高且诱导率仅有2.3倍，b10本底较低但其诱导表达水平和诱导率都显著低于2nt。根据本底低、诱导表达水平高且诱导率筛选得到的克隆提取质粒后，基因测序，获得序列为seq id no.3的茶碱核糖开关，命名为2nt，质粒命名为pbp43-2nt。
[0050]
表1引物
[0051][0052]
注：nnn表示随机序列。
[0053]
实施例2：含不同启动子的2nt重组质粒的构建
[0054]
将启动子p
veg
、p
spovg
、p
ylbp
、p
glpd
(序列见表2)分别与实施例1中获得的茶碱核糖开关2nt适配。以实施例1中获得的pbp43-2nt为模板，分别以p
veg-f/r、p
spovg-f/r、p
ylbp-f/r、p
glpd-f/r为引物(表3)，进行反向pcr，得到质粒pbpylbp-2nt，pbpveg-2nt，pbpspovg-2nt和pbpglpd-2nt。
[0055]
表2启动子序列
[0056][0057][0058]
表3四个启动子克隆引物
[0059][0060]
实施例3：绿色荧光蛋白的重组表达
[0061]
将实施例1和实施例2中得到的序列正确的重组质粒pbp43-2nt，pbpylbp-2nt，pbpveg-2nt，pbpspovg-2nt和pbpglpd-2nt分别转入枯草芽孢杆菌b.subtilis 168中，涂布固体lb培养基，37℃静置培养12-14h后，挑取单菌落于5ml lb种子培养基中，37℃进行培养获得种子液；按终od
600
为0.05将种子液转接至含50ml lb培养基的250ml三角瓶中，分别添加0mm、2mm、4mm、6mm、8mm、10mm茶碱溶液，200rpm，温度37℃，培养24小时。测定荧光值和诱导率，结果如图3所示。分别取添加有0mm和4mm茶碱溶液的样品，破碎细胞并收集上清进行sds-page蛋白电泳。如图4所示，获得29kda左右的电泳条带，且不同泳道条带的差异表明重组枯草芽孢杆菌成功分泌表达了gfp，并且实现了对其表达的调控。
[0062]
如图2和3所示，绿色荧光蛋白的表达情况表现出明显的茶碱依赖，添加茶碱后，gfp荧光值增高。
[0063]
实施例4：2nt用于天冬氨酸酶和β-葡糖醛苷酸的诱导表达
[0064]
将大肠杆菌天冬氨酸基因(genbank登录号：x04066.1)和β-葡糖醛酸苷酶(来源于p43e-gus,cui w.,et al.,engineering an inducible gene expression system for bacillus subtilis from a strong constitutive promoter and a theophylline-activated synthetic riboswitch[j].microb cell fact,2016,15:199)分别克隆到pbp43-2nt穿梭质粒上，得到重组表达质粒pbp43-2nt-apsa和pbp43-2nt-gusa。将重组表达质粒分别转化到b.subtilis 168中，涂布固体lb培养基，37℃静置培养12-14h后，挑取单菌落于5ml lb种子培养基中，37℃进行培养获得种子液；按终od
600
为0.05将种子液转接至含50ml lb培养基的250ml三角瓶中，分别添加0mm和4mm茶碱溶液，200rpm，温度37℃，培养24小时。破碎细胞并收集上清进行sds-page蛋白电泳进行验证，结果如图5所示，茶碱核糖开
关2nt能实现对天冬氨酸酶和β-葡糖醛酸苷酶的表达调控。不加茶碱时，两种重组酶的表达水平均较低；当添加4mm茶碱溶液时，两种酶的表达水平较高，酶活结果见图6，酶活分别达到23.6u/ml、124.5u/ml。
[0065]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。