一种准确检测新生隐球菌的方法与流程

一种准确检测新生隐球菌的方法
1.本技术是申请日为2020年11月11日、申请号为202011254571.x、名称为“一种准确检测新生隐球菌的方法”的发明申请的分案申请。
技术领域
2.本发明属于真菌病原学检测技术领域，具体涉及一种准确检测新生隐球菌的方法。


背景技术：

3.隐球菌是一种病菌，可导致隐球菌病。媒介一般为干的鸽子粪，鲜有人与人之间传播的报告。尚无特效药，一般进行对症处理。隐球菌病是由隐球菌引起的肺部或播散性感染性疾病，主要引起肺炎和脑膜炎，也引起皮肤、骨骼或内脏器官感染。临床上结合临床表现以及显微镜检查结果进行诊断，再通过真菌培养或组织染色加以确认。临床上治疗药物包括两性霉素b、三唑类抗真菌药物和氟胞嘧啶。
4.新生隐球菌(cryptoccus neo formans)属于隐球菌属(cryptococcus)。新生隐球菌为酵母型真菌，外包一层多糖组成的肥厚荚膜，一般染色法不着色，难以发现，故称为隐球菌。新生隐球菌在自然界分布广泛，鸽粪中最多见。人在免疫力低下时，因吸入鸽粪污染的空气而感染，主要引起肺和脑亚急性或慢性感染。肺部作为原发病灶，可扩散至脑部感染，引起慢性炎症和脓肿。新生隐球菌及其变种具有致病性，主要侵犯中枢神经系统。新生隐球菌系环境腐生菌，广泛生存于土壤和鸽粪中。正常人常处于新生隐球菌污染的环境中，但发病者极少。当机体抵抗力降低时，才易侵入人体而致病。由于肿瘤及化疗药物的使用、艾滋病的流行、移植术后免疫抑制药物的使用等原因，新生隐球菌的发病率越来越高，在国外已成为艾滋病患者常见的并发症之一，也是导致患者死亡的重要原因。在我国新生隐球菌的发病率也呈逐年增加的趋势。
5.新生隐球菌无论在组织内或人工培养条件下均呈现圆形的酵母样细胞，其外周有一层较厚的胶质样荚膜，称厚荚膜。菌体直径4-20μm，荚膜宽3-5μm，菌体内有一个或多个反光颗粒，为核结构。部分菌体可见出芽。临床和环境分离菌株一般为无性期的酵母相生长。1976年kwon-chung发现新生变种的有性期，在有性期生长可见菌丝形成。培养诱导实验是观察隐球菌有性期的主要方法。非致病性隐球菌无荚膜。新生隐球菌在沙保培养基和血琼脂培养基上，于25℃和37℃均能生长，非致病性隐球菌则在37℃不能生长。培养数日形成酵母型菌落，表面黏稠，初为乳白色，后转变成橘黄色。此菌能分解尿素，可与假丝酵母菌区别。
6.由于隐球菌感染后仅根据临床表现容易误诊，病原学检测是诊断和治疗的主要依据。现阶段主要的隐球菌检测方法都存在局限性，其中，脑脊液墨汁染色可以初步观察隐球菌的形态，但敏感性低；隐球菌抗原试剂可以快速检测隐球菌抗原，但不能区分新生隐球菌和格特隐球菌；隐球菌培养鉴定也难以鉴定新生隐球菌和格特隐球菌。文献“新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定，冯晓博《中华皮肤科杂志》
2012年”建立了一种基于核糖体基因内间隔区(igs)的多重聚合酶链反应(pcr)，用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌，该方法需要针对每一种菌设计引物，方法比较繁琐，反应不够快捷；专利“cn2017101725670”公开了一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒，属于医学真菌学的领域。根据隐球菌的靶基因，设计该检测隐球菌基因的引物序列如seq id no.3与seq id no.4和/或seq id no.6与seq id no.7所示，其中seq id no.3与seq id no.4对应于新生隐球菌，seq id no.6与seq id no.7对应于格特隐球菌，可以在同一体系中用于特异性检测新生隐球菌与格特隐球菌两种隐球菌”，该方法只是将特异性扩增新生隐球菌和格特隐球菌引物和检测探针进行组合，创新性相对较低，而且两套扩增引物，成本更高，扩增反应相对繁琐。
7.因此，需要新的技术和方法来正确检测并鉴定新生隐球菌。


技术实现要素：

8.本发明为了克服传统检测新生隐球菌的操作繁琐、灵敏度低、错误率高等缺陷，提供一种准确检测新生隐球菌的方法，该方法可以是诊断目的，也可以是非诊断目的。
9.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
10.一种准确检测新生隐球菌的方法，，其特征在于，所述方法包括如下步骤
11.步骤1)选择待测样本；
12.步骤2)提取dna；
13.步骤3)制备实时荧光pcr反应体系；
14.步骤4)荧光pcr扩增。
15.进一步地，所述荧光pcr反应体系包括引物和探针。
16.更进一步地，所述引物由seq id no:1所示的上游引物和seq id no:2所示的下游引物组成；所述探针为检测新生隐球菌的探针。
17.优选地，所述探针为fam
[0018]5’‑
tcggatgatgatcctcagaccgacc-3’bhq1。
[0019]
更优选地，所述荧光pcr反应体系为：
[0020]
reagentsvoume(μl)10
×
extag buffer2.5μloriginal dna1μldntp2μl探针(10nmol/ml)0.5μl上游引物(10nmol/ml)0.5μl下游引物(10nmol/ml)0.5μltakaraextag enzyme(5u/μl)0.25μlultrapure water17.25μl
[0021]
另一方面，本发明还要求保护一种同时检测新生隐球菌和格特隐球菌的实时荧光pcr反应体系，所述实时荧光pcr反应体系为：
[0022][0023][0024]
进一步地，所述引物由seq id no:1所示的上游引物和seq id no:2所示的下游引物组成；所述探针1为检测新生隐球菌的探针，所述探针2为检测格特隐球菌的探针。
[0025]
更优选地，所述探针1为fam
[0026]5’‑
tcggatgatgatcctcagaccgacc-3’bhq1，所述探针2为hex
[0027]5’‑
tcggatgatgatcctgagaccgacg-3’bhq1。
[0028]
与现有技术相比较，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几点：本发明通过基因组学方法比对数十个新生隐球菌和格特隐球菌基因组序列差异，选择保守序列和差异序列，设计出引物和探针，在进行检测和鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的过程中，具备敏感性高、特异性强的特点。另外，利用本发明试剂盒检测新生隐球菌和格特隐球菌时操作简单、检测时间短、适用性强的特点，本发明将检测新生隐球菌和格特隐球菌时所需的原料放在同一反应体系内，可同时检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，明确病原菌种类，帮助进行快速准确的临床早期诊断，减少药物滥用，为疾病治疗赢得宝贵时间。
附图说明
[0029]
图1：新生隐球菌在不同浓度dna(50ng，5ng，0.5ng，0.05ng)的扩增曲线；
[0030]
图2：格特隐球菌在不同浓度dna(50ng，5ng，0.5ng，0.05ng)的扩增曲线；
[0031]
图3：新生隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；
[0032]
图4：格特隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；
[0033]
图5：新生隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌；
[0034]
图6：格特隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌。
具体实施方式
[0035]
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发
明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0036]
实施例1
[0037]
新生隐球菌与格特隐球菌检测与鉴定的靶基因、引物、探针及其试剂盒
[0038]
通过高通量测序技术获得了数十个新生隐球菌和格特隐球菌基因组序列，通过基因组学方法比对数十个隐球菌基因组序列差异，选择cap59序列作为靶基因，该基因片段在两种隐球菌种内比较保守，并在新生隐球菌和格特隐球菌间存在差异。检测新生隐球菌和格特隐球菌靶基因的核苷酸序列如seq id no:5和seq id no:6所示。
[0039]
针对选择的靶基因序列信息，采用primer软件进行引物设计。通过反复对比分析，最终设计出能够用于新生隐球菌和格特隐球菌检测与鉴定的实时荧光pcr检测引物和探针；所述特异性检测与鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的特异性寡核苷酸引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，该引物对是检测新生隐球菌和格特隐球菌的通用引物。所述检测新生隐球菌的探针序列如seq id no:3所示，检测格特隐球菌的探针序列如seq id no:4所示，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团，5’端连接有一个荧光报告基团。
[0040]
所述引物序列如seq id no:1所示：
[0041]5’‑
gtattcgatacggtggttgaacaga-3’(tm＝62.4℃)和seq id no:2所示：5
’‑
ggttccaacgaccagacaaagg-3’(tm＝63.2℃)；所述探针序列分别为seq id no:3所示：fam
[0042]5’‑
tcggatgatgatcctcagaccgacc-3’bhq1用于检测新生隐球菌(tm＝70.2℃)，和seq id no:4所示：hex
[0043]5’‑
tcggatgatgatcctgagaccgacg-3’bhq1用于检测格特隐球菌(tm＝71.1℃)。
[0044]
所述引物特异性识别新生隐球菌中seq id no:5所示的序列和格特隐球菌中seq id no:6所示的序列。用于检测隐球菌的试剂盒，能够同时检测新生隐球菌和格特隐球菌，包括一对通用引物和分别用于检测新生隐球菌和格特隐球菌的探针，还包括缓冲液、dntps、mgcl2、taq dna聚合酶等。
[0045]
一、试验材料：实验材料见表1
[0046]
二、主要试剂与仪器
[0047]
dna提取采用天根公司酵母基因提取试剂盒；引物和探针的合成由生物工程有限公司完成；dna聚合酶和dntps购自takara公司；荧光定量pcr仪购于roche公司。
[0048]
三、实验方法
[0049]
dna提取和浓度测定：按照dna提取试剂盒说明书提取dna，使用分光光度计，测定样品中dna含量，测定od260/od280比值。
[0050]
实时荧光pcr反应体系见表1。扩增条件为：95℃预变性10min；95℃ 10s，60℃ 60s，45个循环，获得扩增结果。
[0051]
表1实时荧光pcr扩增反应体系(25μl)
[0052]
reagentsvoume(μl)10
×
extag buffer2.5μloriginal dna1μldntp2μl探针(10nmol/ml)0.5μl
上游引物(10nmol/ml)0.5μl下游引物(10nmol/ml)0.5μltakaraextag enzyme(5u/μl)0.25μlultrapure water17.25μl
[0053]
四、分析判断扩增结果
[0054]
样品的实时荧光pcr反应体系中，fam荧光有荧光对数增长，且ct值≤30.0时，则新生隐球菌检测结果为阳性；若样品的实时荧光pcr反应体系中，hex荧光有荧光对数增长，且ct值≤30.0时，则格特隐球菌检测结果为阳性。
[0055]
五、敏感度、特异性和重复性检测
[0056]
敏感度检测：将提取的新生隐球菌和格特隐球菌的模板dna稀释成以下浓度：50ng/μl，5ng/μl，0.5ng/μl，0.05ng/μl，经荧光定量pcr方法检测得到新生隐球菌和格特隐球菌的最低可检测浓度，如图1-2所示新生隐球菌和格特隐球菌的最低下限可检测浓度为0.05ng/μl，灵敏度较高。
[0057]
重复性检测：将新生隐球菌和格特隐球菌分别重复试验，如图3-4所示，各自三个反应的结果一致，重复性优异。
[0058]
特异性检测：所设计的引物分别对新生隐球菌和格特隐球菌进行特异性扩增，所设计的探针能鉴定新生隐球菌和格特隐球菌。平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌，如图5-6所示，结果均为阴性，没有非特异性扩增曲线。
[0059]
本发明通过引物和探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光pcr检测方法特异性高，假阳性低。检测pcr扩增后的荧光，放大了反应信号，灵敏度大大提高。本发明的方法巧妙地运用pcr技术的dna高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确、灵敏度高等优点，对新生隐球菌和格特隐球菌最低下限可检测浓度为0.05ng/μl，有利用精确区分两种隐球菌感染，灵敏度远优于现有试剂盒。本发明用于临床能有利于医师进行对新生隐球菌和格特隐球菌感染疾病的早期快速区分和诊断，改善治疗方案，减少药物的滥用。本发明技术方案操作方便，易于推广，具有较好的应用前景。
[0060]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。