一种重叠环介导等温核酸扩增技术的制作方法

1.本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重叠环介导等温核酸扩增技术。


背景技术：

2.环介导等温核酸扩增技术（loop
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mediated isothermal amplification, lamp）是一种新的恒温核酸扩增方法，具体为针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换dna聚合酶等温(65℃左右)保温一段时间，即可完成核酸扩增反应。与常规pcr相比，lamp不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强、灵敏度高的特点。
3.但由于lamp扩增用的引物比较多，因此很难在同一个反应体系中进行双基因乃至多基因检测。目前虽然存在可以在同一反应体系中进行多基因检测的探针法，但该方法使用引物较多，体系相对繁琐复杂，引物设计难度高，反应干扰比较大，应用前景不理想。
4.因此，如果能提供一种引物设计简单、反应结果清晰的lamp多基因检测方法，将具有重要的学术价值和商业价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种重叠环介导等温核酸扩增技术。
6.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种环介导等温核酸扩增技术用扩增引物，所述扩增引物包括：（1）上游基因lamp的正向引物f，（2）下游基因lamp的反向引物r，（3）上游基因和下游基因的重叠引物，（4）中间基因与上游基因反应的反向lamp引物，（5）中间基因与下游基因反应的正向lamp引物，（6）相邻两条基因接头处的重叠引物。
7.优选的，各所述重叠引物分别包括正向引物f和反向引物r，正向引物f右边为拼接dna序列下游dna的正常pcr引物f，左边为带有上游dna正义连序列或者和反向引物r互补的特定序列，反向引物r左边为拼接dna上游dna的正常pcr引物r，右边为带有下游dna反义序列或者和正向引物f互补的特定序列。
8.相应的，所述扩增引物在2个及以上基因检测中的应用。
9.优选的，所述应用方法包括：以fip、bip为内引物，所述重叠引物为叠加引物，以f3、b3为外引物对基因进行扩增。
10.优选的，所述方法的反应体系包括：1mm dntps、2.5μl 10
×
bst buffer、8u bst dna聚合酶、2μl待检测基因、外引物各0.2μm、内引物各1.2μm、重叠引物各0.2μm,ddh2o补齐至25μl。
11.优选的，反应条件为：65℃、60min。
12.优选的，所述反应发生在液体中或固体表面。
13.优选的，扩增对象为dna和/或rna。
14.优选的，所述应用为在检测病原体病毒、病原体细菌、病原体真菌、衣原体中的应用。
15.相应的，利用所述扩增引物制备的检测用试剂、试纸、试剂盒。
16.本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的lamp引物设计及基因检测方法，首次提出了“重叠引物”的概念和设计思路，通过设计特异性的重叠引物，帮助多基因实现重叠环介导等温核酸扩增反应，引物设计方法简单、反应结果准确、反应效率高。
17.本发明提供的方法可以用于检测冠状病毒、hiv、乙肝、丙肝、流感、脑膜炎等病毒性疾病的病原体病毒、细菌性疾病的病原体细菌、病原体真菌、治病衣原体等，从而可用于肿瘤的诊断、肿瘤的分型恶性程度的鉴定；以及其它人体/动物/植物疾病的诊断和食品卫生的监测。
附图说明
18.图1为ms2引物设计示意图；图2为实施例一核酸电泳反应结果示意图；图3为sgiv引物设计示意图；图4为ms2
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sgiv重叠引物设计示意图；图5为cchfv引物设计示意图；图6为实施例二核酸电泳反应结果示意图；图7为hcv引物设计示意图；图8为cchfv
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hcv重叠引物设计示意图；图9为多基因设计原理示意图；图10为实施例三核酸电泳反应结果示意图。
具体实施方式
19.本发明提供了一种重叠环介导等温核酸扩增检测方法，具体包括如下步骤：1、设计重叠环介导等温核酸扩增引物。设计原理如图9所示。具体的，多基因检测的扩增引物包括：上游基因lamp的正向引物f、下游基因lamp的反向引物r，及上游基因和下游基因的两条重叠引物，中间基因需要设计与上游基因反应的反向lamp引物，以及和下游基因反应的正向lamp引物，相邻两条基因接头处设计重叠引物。
20.各所述重叠引物包括正向引物f和反向引物r，正向引物f右边为拼接dna序列下游dna的正常pcr引物f，左边为带有上游dna正义连序列或者和反向引物r具有互补的特定序列，反向引物r左边为拼接dna上游dna的正常pcr引物r，右边为带有下游dna反义序列或者和正向引物f具有互补的特定序列，重叠引物任意一条或者多条同时含有上下游dna的序列不少于15bp。各引物可以使用引物设计程序例如primerexplorer进行设计。
21.通过设计特异性的重叠引物，使多基因能够进行重叠环介导等温核酸扩增的反应。
22.2、设计重叠环介导等温核酸扩增的扩增体系及方法。具体方法为：以fip（forward inner primer,上游内部引物）、bip（backward inner primer,下游内部引物）为内引物，重叠引物为叠加引物，以f3（forward outer primer，上游外部引物）、b3（backward outer primer，下游外部引物）为外引物对双基因进行恒温扩增。其反应体系为：1mm dntps（三磷酸脱氧核糖核苷酸），2.5μl 10
×
bst buffer，8u bst dna聚合酶，2μl待检测基因，外引物
各0.2μm，内引物各1.2μm，重叠引物各0.2μm,ddh2o补齐至25μl。将上述所有试剂混匀置于pcr管中，65℃、60min。
23.通过反应体系的设计使重叠环介导等温核酸扩增能将目的dna或者rna分子大量复制或先经过逆转录后大量复制，产生的扩增产物具有多重重复序列的dna。
24.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
25.实施例一：设计重叠引物并扩增ms2
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sgiv特异性基因效果展示1、设计引物检测ms2特异性基因。ms2基因序列如seq id no.1所示，设计ms2引物如图1所示，引物序列具体如表1所示，反应体系如表2所示。
26.表1 环介导等温核酸扩增ms2引物序列表2 反应体系
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图1（1～4）所示。图2中，m为dl2000 dna marker，1、2为ms2反应胶图，lamp正常反应，3、4为阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
27.2、设计引物检测sgiv特异性基因。sgiv基因序列如seq id no.2所示，设计sgiv引物如图3所示，引物序列具体如表3所示，反应体系如表4所示。
28.表3 环介导等温核酸扩增sgiv引物序列
表4 反应体系将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图2（5～8）所示。图2中，m为dl2000 dna marker，5、6为sgiv反应胶图，lamp正常反应，7、8为阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
29.3、设计重叠引物并扩增检测ms2
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sgiv双基因。按上述方法设计ms2
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sgiv重叠引物，如图4所示。引物序列具体如表5所示，反应体系如表6所示。
30.表5 重叠环介导等温核酸扩增ms2
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sgiv引物序列表6 反应体系
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图2（9～12）所示。图2中，m为dl2000 dna marker，9、10为双基因反应胶图，lamp正常反应，11、12为阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
31.4、在缺少重叠引物的情况下检测ms2
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sgiv双基因。模板序列分别使用本实施例步骤1、2的序列，具体如表7所示，反应体系如表8所示。
32.表7 环介导等温核酸扩增ms2
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sgiv引物序列
表8 反应体系将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图2（13～16）所示。图2中，m为dl2000 dna marker，13、14为双基因反应胶图，lamp没有反应，15、16为阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
33.5、用步骤3中（重叠环介导等温核酸扩增ms2
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sgiv引物序列）ms2的反向引物和sgiv的正向引物，在重叠引物下进行ms2
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sgiv双基因检测。具体引物如表9所示，反应体系
如表10所示。
34.表9 ms2的反向引物和sgiv的正向引物表10 反应体系将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图2
（17～20）所示。图2中，m为dl2000 dna marker，17、18为双基因反应胶图，lamp没有反应，19、20为阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
35.实施例二：设计重叠引物并扩增cchfv
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hcv特异性基因效果展示1、设计引物检测cchfv特异性基因。cchfv基因序列如seq id no.3所示，设计cchfv引物如图5所示，引物序列具体如表11所示，反应体系如表12所示。
36.表11 环介导等温核酸扩增cchfv引物序列表12 反应体系将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图6（1
～4）所示。图6中，m为dl2000 dna marker，1、2为cchfv反应胶图，lamp正常反应，3、4为阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
37.2、设计引物检测hcv特异性基因。hcv基因序列如seq id no.4所示，设计hcv引物如图7所示，引物序列具体如表13所示，反应体系如表14所示。
38.表13 环介导等温核酸扩增hcv引物序列表14 反应体系将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图6（5～8）所示。图6中，m为dl2000 dna marker，5、6为hcv反应胶图，lamp正常反应，7、8为阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
39.3、设计重叠引物并扩增检测cchfv
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hcv双基因。按上述方法设计cchfv
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hcv重叠引物，如图8所示。引物序列具体如表15所示，反应体系如表16所示。
40.表15 重叠环介导等温核酸扩增cchfv
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hcv引物序列表16 反应体系
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图6（9～12）所示。图6中，m为dl2000 dna marker，9、10为双基因反应胶图，lamp正常反应，11、12为阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
41.4、在缺少重叠引物的情况下检测cchfv
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hcv双基因。模板序列分别使用本实施例步骤1、2的序列，具体如表17所示，反应体系如表18所示。
42.表17 环介导等温核酸扩增ms2
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sgiv引物序列表18 反应体系
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图6（13～16）所示。图6中，m为dl2000 dna marker，13、14为双基因反应胶图，lamp没有反应，15、16为阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
43.实施例三：设计重叠引物扩增ms2
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hcv
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sgiv特异性基因效果展示1、按照实施例一、二步骤3分别设计双基因ms2
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hcv和双基因hcv
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sgiv重叠引物，按照多基因设计原理设计lamp引物；具体如图9所示。引物序列具体如表19所示，反应体系如表20所示。
44.表19 重叠环介导等温核酸扩增ms2
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hcv
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sgiv引物序列
表20 反应体系
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图10（1～4）所示。图10中，m为dl2000 dna marker，1、2为三基因反应胶图，lamp正常反应，3、4为
阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
45.2、在缺少hcv模板的情况下检测ms2、hcv、sgiv三基因。模板序列分别使用本实施例步骤1的序列，具体如表21所示，反应体系如表22所示。
46.表21 环介导等温核酸扩增ms2
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,hcv,sgiv引物序列表22 反应体系
将上述反应体系在恒温水浴锅中进行，65℃、60分钟，进行核酸电泳，结果如图10（5～8）所示。图10中，m为dl2000 dna marker，5、6为三基因反应胶图，lamp没有反应，7、8为
阴性对照，用只加puc19质粒dna为阴性对照。
47.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。