检测SNP分子标记的试剂在山羊RBP4基因分型和/或山羊分子标记辅助育种中的应用

检测snp分子标记的试剂在山羊rbp4基因分型和/或山羊分子标记辅助育种中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记检测技术领域，具体地说，涉及检测snp分子标 记的试剂在山羊rbp4基因分型和/或山羊分子标记辅助育种中的应用。


背景技术：

2.视黄醇结合蛋白4(rbp4)属于脂质运载蛋白家族(lipocalin proteinfamily)的一员，是一种典型的小分泌蛋白，表现出广泛的结构和功能多样 性。视黄醇结合蛋白(retinol-binding proteins，rbps)是动物体内一类将维生 素a从肝中转运至靶组织以及实现维生素a的细胞内转运代谢的特异的运 载蛋白、在协助维生素a发挥生理功能中起着不可替代的作用，rbp4是孕 体产生的主要蛋白质之一。rbp4位于山羊26号染色体上，包含6个外显子， 编码区总长612bp，编码蛋白含氨基酸203个。维生素a(视黄醇)是多种组 织正常发育所需的关键营养素，包括那些与生殖性能有关的组织，如卵泡发 育、卵母细胞成熟和胚胎发育等。而视黄醇作用的发挥依赖于其载体蛋白视 黄醇结合蛋白(rbps)的结合和运输。有研究表明，rbp4在猪妊娠的关键时 期表达，在胚胎发育过程中起着重要作用。
3.目前还没有关于rbp4基因在山羊繁殖调控中的研究公开。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供检测snp分子标记的试剂在山羊rbp4基因分型 和/或山羊分子标记辅助育种中的应用。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了检测snp分子标记的试剂在山羊rbp4基因分型和/或山 羊分子标记辅助育种中的应用，根据ensembl数据库最新版本rbp4的注释 (enschig00000023599)，所述snp分子标记位于山羊26号染色体的第 36491960位碱基，该位置为rbp4基因的5’调控区，该处碱基为g或c； 所述snp分子标记与山羊产羔数具有显著的相关性。
7.优选的，所述snp分子标记的cc或gc基因型对应的山羊产羔数高于gg基因型对应的山羊产羔数。
8.优选的，所述山羊分子标记辅助育种包括高产羔数山羊的早期筛选。
9.优选的，所述山羊的品种包括云上黑山羊。
10.优选的，所述检测snp分子标记的试剂包括引物组；所述引物组包括 primer_allelefam、primer_allelehex和primer_common；所述 primer_allelefam的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述 primer_allelehex的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述primer_common 的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.优选的，检测所述snp分子标记包括以下步骤：
12.1)提取待测山羊的基因组dna；
13.2)以待测山羊的基因组dna为模板，利用权利要求5中所述的引物组 进行kasp分
型，确定所述snp位点的基因型，当基因型为cc或gc时， 判断山羊产羔数高；当基因型为gg时，判断山羊产羔数低。
14.优选的，每个kasp分型的反应体系中dna模板的用量为5～50ng。
15.优选的，每个kasp分型的反应总体系为5.07μl，包括：2.5μl 2xmastermix、0.07μl primermix和2.5μl dna模板。
16.本发明提供了检测snp分子标记的试剂在山羊rbp4基因分型和/或山羊 分子标记辅助育种中的应用，根据ensembl数据库最新版本rbp4的注释 (enschig00000023599)，所述snp分子标记位于山羊26号染色体的第 36491960位碱基，该位置为rbp4基因的5’调控区，该处碱基为g或c；所述 snp分子标记与山羊产羔数具有显著的相关性。通过对山羊rbp4基因型进行 选择，将具有高产羔数性状的cc型和较高产羔数的gc型个体选留下来，淘 汰产羔数较低的gg型个体，从而提高山羊的繁殖力，对山羊大规模分子育 种具有潜在的应用价值。
附图说明
17.图1为mix工作液分装示意图；
18.图2为本发明实施例1中利用kasp技术对rbp4基因进行分型检测的结 果，存在gg、gc和cc三种基因型。
具体实施方式
19.本发明提供了检测snp分子标记的试剂在山羊rbp4基因分型和/或山 羊分子标记辅助育种中的应用，根据ensembl数据库最新版本rbp4的注释 (enschig00000023599)，所述snp分子标记位于山羊26号染色体的第 36491960位碱基，该位置为rbp4基因的5’调控区，该处碱基为g或c； 所述snp分子标记与山羊产羔数具有显著的相关性。
20.在本发明中，所述snp分子标记的cc或gc基因型对应的山羊产羔数 高于gg基因型对应的山羊产羔数。
21.在本发明中，所述山羊分子标记辅助育种优选的包括高产羔数山羊的早 期筛选。
22.在本发明中，所述检测snp分子标记的试剂优选的包括基于kasp技 术开发的用于检测所述snp分子标记的引物组；所述引物组包括 primer_allelefam、primer_allelehex和primer_common；所述 primer_allelefam的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体为： gaaggtgaccaagttcatgctctcccgacagtgagcggcggccg；所述 primer_allelehex的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体为： gaaggtcggagtcaacggattctcccgacagtgagcggcggccc；所述 primer_common的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体为： cggtccccaggctccatcttgcc。
23.在本发明中，用于检测所述snp分子标记的引物组基于核苷酸序列如 seq id no.4所示的rbp4基因设计得到，具体为： gcgttatgcaagtgctggcccgccggccccggcgcctccccctcggtc tttcaccccgcgccgttacgaaagcgcgaccccctccccccggagcta taaagccgcccggcggcccccgcggcgcgctcgccttgctggctccac gcgcgctcggacccgcggccaggcttgcgcgcagctcccgacagtga gcggcggccsggcgggatggggggccggcgcgggagggatgggggcc cgggatgggtgtgatgaggctctgggggcgggcgggatgggaagccg gggggctggcgggaggagggcccctcgcgggcaagatggagcctggg gaccggtggtggagggccgagtggtccagccgccgggcgctcacggc gcgcggtccccgcaggcggact。注：s为snp所在
位置，s为g或c。
24.在本发明中，检测snp分子标记优选的包括以下步骤：
25.1)提取待测山羊的基因组dna；
26.2)以待测山羊的基因组dna为模板，利用上述方案所述引物组，进行 kasp分型，确定所述snp位点的基因型，当基因型为cc或gc时，判断 山羊产羔数高；当基因型为gg时，判断山羊产羔数低。
27.本发明首先提取待测山羊的基因组dna。在本发明实施例中采用的是 云上黑山羊；本发明对所述待测山羊基因组的提取方法没有特殊限定，采用 本领域常规的动物细胞基因组提取方法即可。
28.得到待测山羊的基因组dna后，优选的还包括：对提取得到的待测山 羊的基因组dna的浓度进行调试；每个kasp分型的反应体系中dna模 板的用量优选为5～50ng，更优选为10～30ng，最优选为20ng。
29.得到浓度调整后的待测山羊的基因组dna，本发明以浓度调整后的待 测山羊的基因组dna为模板，利用上述方案所述引物组，进行kasp分型， 确定所述snp位点的基因型，当基因型为cc或gc时，判断山羊产羔数高； 当基因型为gg时，判断山羊产羔数低。
30.在本发明中，所述优选的kasp分型的反应总体系为5.07μl，包括：2.5μl 2xmaster mix、0.07μl primer mix和2.5μl dna模板。
31.在本发明中，所述kasp分型优选的包括以下步骤：
32.s1.按照表4配制mix工作液(包括2xmastermix和primermix)；
33.s2.取所述mix工作液2.57μl按照图1所述孔板排布表分装到384孔板 中；
34.s3.取浓度调整后的待测山羊的基因组dna2.5μl分装到384孔板中；
35.s4.按照图1所述孔板排布表在对应的位置加入5.07μl ntc试剂；所述 ntc试剂为阴性对照，包括2.57μl mix工作液和2.5μlrnase-free wate；
36.s5.对384孔板进行封口后瞬时离心；
37.s6.对384孔板进行封口后瞬时离心后，进行pcr扩增，得到pcr产物；
38.s7.对所述pcr产物进行数据扫描，分析分型结果，根据山羊rbp4基 因型的判定结果，从而判定待测山羊是否为高产羔数山羊品种；具有cc或 gc基因型的山羊产羔数高，具有gg基因型的山羊产羔数较低。
39.本发明首先按照表4配制mix工作液；在本发明中，配制后的mix工 作液优选的采用移液器轻轻吹打5次至混匀后瞬时离心；所述瞬时离心的转 速优选为3000rpm；
40.配制mix工作液后，本发明取所述mix工作液按照图1所述孔板排布 表分装到384孔板中；在本发明中，每个384孔板的mix工作液的分装量优 选为2.57μl。
41.分装mix工作液后，本发明取浓度调整后的待测山羊的基因组dna分 装到384孔板中；在本发明中，每个384孔板的浓度调整后的待测山羊的基 因组dna的分装量优选为2.5μl。
42.本发明按照图1所述孔板排布表在对应的位置加入ntc试剂。
43.本发明对384孔板进行封口后瞬时离心；在本发明中，所述封口优选的 采用专用封口膜进行，封口后优选的还包括使用刮板将孔板四周刮紧；所述 瞬时离心的温度优选为4℃；所述瞬时离心的转速优选为1200rpm；所述离 心的作用是收集样品至孔底，看孔底是
否有气泡，如果有用手轻弹2次再次 进行1200rpm瞬甩离心。
44.对384孔板进行封口后瞬时离心后，进行pcr扩增，得到pcr产物； 在本发明中，所述pcr扩增的程序如表5所示。
45.得到pcr产物后，本发明对所述pcr产物进行数据扫描，分析分型结 果，根据山羊rbp4基因型的判定结果，从而判定待测山羊是否为高产羔数 山羊品种；具有cc或gc基因型的山羊产羔数高，具有gg基因型的山羊 产羔数较低；所述数据扫描参照《abi7900 ht fast realtime pcr system实 验操作规程》。
46.本发明基于kasp技术检测山羊rbp4基因型，与传统的pcr-rflp检 测基因型等方法相比，该技术更灵敏，准确性更高，性价比更高，所需dna 样本需求低(根据基因组大小不同只需0.1～10ng)，且无需全基因组扩增， 使用更方便，方便推广。利用本发明的方法可对rbp4基因的snp位点实现 自动化检测，可以将具有较高产羔数性状的cc或gc基因型个体选留下来， 淘汰产羔数较低的gg基因型个体，从而提高山羊的繁殖力，对山羊大规模 分子育种具有潜在的应用价值。
47.实施例1利用kasp技术检测山羊rbp4基因型并筛选产羔数较高的 山羊的方法
48.1.实验材料
49.选取400只云上黑山羊为检测对象。
50.2.试剂及仪器
51.试剂：表1
52.试剂名称型号kasptm indirect assay reagentslgc-kbs-2100-100-oli引物lgc-kbd assayrnase-free waterwater天根-rt121-02
53.仪器：表2
54.仪器名称来源型号pcr仪abi9700离心机eppendorf5418nanodropthermo2000涡旋混合器其林贝尔ql-901型(点动、连续)离心机eppendorf5810r荧光定量pcr仪abi7900
55.基因组dna的提取
56.山羊颈静脉采血1ml，用edta抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解去除 不含dna的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组dna，然后蛋 白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组dna通过异丙醇沉淀并 重溶解于dna溶解液。
57.kasp技术进行基因分型
58.针对山羊第26号染色体上第36491960bp位点(ensembl注释： enschig00000023599)设计引物组合，引物序列见表3。
59.表3
[0060][0061][0062]
检测流程如下：
[0063]
步骤一：提取待测山羊的基因组dna；
[0064]
步骤二：dna样本浓度调试；
[0065]
根据检测样本状况不同，对dna浓度进行调试，基因组dna的用量优选为5～50ng，更优选为10～30ng，最优选为20ng。
[0066]
步骤三：浓度调整后的dna进行kasp实验验证；
[0067]
1)mix工作液配制
[0068]
按照下表进行mix工作液的配制，配制时要按照操作卡片认真核对要加试剂的名称及加入量，配完后用移液器轻轻吹打5次至混匀，3000rpm瞬时离心；
[0069]
表4
[0070][0071]
2)mix工作液分装
[0072]
把配制好的mix工作液2.57μl按照孔板排布表进行分装，分装到相应的384孔板中，如图1所示；
[0073]
3)dna样本分装
[0074]
根据孔板排布把浓度调整好的dna取2.5μl分装到相应位置的384孔板中；
[0075]
4)ntc分装
[0076]
按照孔板排布表在对应的位置加入ntc试剂(阴性对照)，包括：2.57μlmix工作液和2.5μlrnase-freewater；
[0077]
5)384孔板封膜
[0078]
取专用封口膜对孔板进行封口，使用刮板将孔板四周刮紧。将384孔板放到4℃离心机中，1200rpm瞬甩离心，收集样品至孔底，看孔底是否有气泡，如果有用手轻弹2次再次进行1200rpm瞬甩离心；
[0079]
进行如下pcr程序
[0080]
表5
[0081][0082]
步骤四：数据扫描
[0083]
pcr结束后，取出孔板，进行数据扫描，具体参照《abi7900htfastrealtimepcrsystem实验操作规程》
[0084]
分析分型结果，判断山羊rbp4基因型36491960bp位点的基因型。
[0085]
待测山羊第26号染色体上第36491960bp位点不同基因型分析统计结果见表6。
[0086]
表6
[0087][0088]
表7
[0089]
表7
[0090][0091]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。