一种重组鲎三因子组合物及其检测内毒素的方法与流程

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组鲎三因子组合物及其检测内毒素的方法。


背景技术：

2.内毒素是存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁外膜上的脂多糖，且已知是强致热原。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏细菌细胞后才释放出来，它可以激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热，休克甚至死亡，因而内毒素检测的药厂制药和医疗设备制造中必须的一道程序。
3.鲎试验是国际上至今为止检测内毒素的金标准，具有简单、快速、灵敏度高等特点。传统的鲎试验是使用鲎血细胞提取液(鲎的变形细胞溶解物)进行测定。在内毒素与溶解物接触后，存在于溶解物中的作为丝氨酸蛋白酶前体的c因子被活化而生成活化型c因子；该活化型c因子使存在于溶解物中的b因子活化，生成活化型b因子，该活化型b因子使存在于溶解物种的凝固酶原活化，生成凝固酶，凝固酶再被水解成凝固蛋白凝胶或者是将其与合成底物发生作用而显色以测定内毒素。然而，使用鲎血细胞提取液使得海洋中鲎的数量逐渐减少。
4.相关技术中，使用昆虫细胞或者哺乳动物细胞作为宿主细胞来表达c因子、b因子及凝固酶原，重构级联反应体系，但是其表达的c因子为不溶性、非分泌和低活性的。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种重组鲎三因子组合物，使用哺乳类细胞hek293表达c因子、b因子和pce因子，三种因子同时表达增强c因子活性，提高灵敏度，并且表达后的因子是可分泌和具有相对较高的活性。
6.为此，在本发明的第一个方面中，提供了一种重组鲎三因子组合物，包括重组鲎c因子、重组鲎b因子和重组鲎凝固酶原因子；所述重组鲎c因子、重组鲎b因子和重组鲎凝固酶原因子均由哺乳动物细胞hek293表达。
7.根据本发明的实施例，采用哺乳动物细胞hek293同时表达鲎c因子、鲎b因子和鲎凝固酶原因子，将这三因子用于内毒素检测，半小时即可获定性定量的检测内毒素，三种因子同时表达增强c因子活性，提高灵敏度，并且表达后的因子是可分泌和具有较高活性的。
8.可选地，所述重组鲎c因子的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述重组鲎b因子的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述重组鲎凝固酶原因子的核苷酸序列如seq id no：3所示。由此通过密码子优化，使得三因子更适于哺乳细胞表达。
9.可选地，所述重组鲎c因子、重组鲎b因子和重组鲎凝固酶原因子的制备包括如下步骤：
10.(1)以seq id no：4所示的基因为模板，seq id no：8、seq id no：9为引物对c因子
进行pcr扩增，获得factorc-his6-apai；以seq id no：5所示的基因为模板，seq id no：10、seq id no：11为引物对b因子进行pcr扩增，获得factorb-his6-apai；以seq id no：6所示的基因为模板，seq id no：12、seq id no：13为引物对pce因子进行pcr扩增，获得pce-his6-apai；以seq id no：7所示的基因为模板，seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17为引物对gp67进行pcr扩增，获得kpni-gp67-1、kpni-gp67-2和kpni-gp67-3；
11.(2)将kpni-gp67-1基因片段与factorc-his6-apai基因片段连接，获得kpni-gp67-factorc-his6-apai；将kpni-gp67-2基因片段与factorb-his6-apai基因片段连接，获得kpni-gp67-factorb-his6-apai；将kpni-gp67-3基因片段与pce-his6-apai基因片段连接，获得kpni-gp67-pce-his6-apai；
12.(3)将kpni-gp67-factorc-his6-apai基因片段、kpni-gp67-factorb-his6-apai基因片段和kpni-gp67-pce-his6-apai基因片段分别与pcdna载体连接，获得重组质粒pcdna-gp67-factorc、pcdna-gp67-factorb和pcdna-gp67-pce，重组质粒再转染哺乳动物细胞hek293，培养表达纯化蛋白，获得重组鲎c因子、重组鲎b因子和重组鲎凝固酶原因子。
13.在本发明的第二方面中，提供了一种应用上述重组鲎三因子组合物检测内毒素的方法，包括如下步骤：
14.(1)配置至少3个不同浓度的内毒素标准液；
15.(2)将所述重组鲎c因子、重组鲎b因子和重组鲎凝固酶原因子与荧光底物、细菌内毒素检查用水和buffer混合制得混合液；
16.(3)将所述混合液与每个所述的内毒素标准液按1:1的体积加入微孔板中，同时设置阴性对照组；
17.(4)将微孔板置于荧光微孔板检测仪中检测；
18.(5)以荧光强度变化值为纵坐标，内毒素标准溶液的溶度为横坐标，做标准曲线。
19.根据本发明实施例检测内毒素的方法，通过上述鲎三因子组合物可提高检测的灵敏度，大大的缩短检测时间。
20.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
21.图1为根据本发明实施例的扩增后的电泳验证图；
22.图2为根据本发明实施例的c因子、b因子和pce因子的基因及经双酶切后的电泳图；
23.图3为根据本发明实施例的重组质粒经双酶切后的电泳图；
24.图4为根据本发明实施例的sds-page纯化结果；
25.图5为根据本发明实施例的动态浊度法检测内毒素的结果图；
26.图6为根据本发明实施例的c因子荧光法检测内毒素的结果图；
27.图7根据本发明实施例的c因子、b因子、pce因子荧光法检测内毒素的结果图；
28.图8根据本发明实施例的另一c因子、b因子、pce因子荧光法检测内毒素的结果图。
具体实施方式
29.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
30.下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5
′
至3
′
的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
31.本发明的重组鲎三因子是重组的鲎c因子，鲎b因子，鲎凝固酶原因子。其中，鲎c因子，鲎b因子，鲎凝固酶原因子在下文中可以分别被称作c因子、b因子、pce因子。其中，鲎可以是中国鲎、圆尾鲎或美洲鲎。
32.下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。
33.实施例1制备重组c因子、b因子、pce因子
34.1、构建鲎c、b和pce因子蛋白重组表达质粒
35.按照碱基序列1(genbank：d90271.1)、序列2(id：ma626413.1)、序列3(id：m58366.1)和序列4(id：x58376.1)，分别由生工生物公司合成c因子的碱基序列(seq id no：4)、b因子的碱基序列(seq id no：5)、pce因子的碱基序列的碱基序列(seq id no：6)和gp67信号肽碱基序列(seq id no：7)；根据基因序列，利用premier primer 5设计如下引物：
36.c-f：actactattattaacatggtgctggctagctttct；(seq id no：8)
37.c-r：ggagggccctcaatgatgatgatgatgatggatgaactgccggatcc；(seq id no：9)
38.b-f:actactattattaacatgacctggatctgcgtgat；(seq id no：10)
39.b-r:agggggccctcaatgatgatgatgatgatggttggtcacggcgtgat；(seq id no：11)
40.pce-f：actactattattaacatgctggtcaacaacgtgtt；(seq id no：12)
41.pce-r：agggggcccttaatgatgatgatgatgatgcaccatgtgctcggcga；(seq id no：13)
42.其中gp67信号肽需要设计三对引物序列，分别对应c因子、b因子和pce因子：
43.1-f：cggggtaccatgctactagtaaatcagtc；(seq id no：14)
44.1-r：gctagccagcaccatgttaataatagtagtgtcac；(seq id no：15)
45.2-r：gcagatccaggtcatgttaataatagtagtgtca；(seq id no：16)
46.3-r：gttgttgaccagcatgttaataatagtagtgtcac；(seq id no：17)
47.以合成的gp67碱基序列为模板，对gp67基因进行扩增，用引物1-f分别跟1-r、2-r和3-r进行pcr反应，引入了kpni酶切位点，得到名为kpni-gp67-1、kpni-gp67-2和kpni-gp67-3的pcr产物；扩增反应体系：ddh2o 33.5μl、10*buffer 5μl、dntps 5μl、mgso
4 2μl、kod 1μl、上游引物1.5μl、下游引物1.5μl、dna模板0.5μl；pcr反应步骤：94℃2min、94℃15s、53℃30s、68℃40s、68℃5min(第2步到第4步循环29次)。
gp67-pce-his6-apai；4为pcdna质粒(kpni和apai双酶切)；5为kpni-gp67-factorc-his6-apai(kpni和apai双酶切)；6为kpni-gp67-factorb-his6-apai(kpni和apai双酶切)；7为kpni-gp67-pce-his6-apai(kpni和apai双酶切)。在图3中，1为pcdna-gp67-factorc(hindii酶切验证)；2为pcdna-gp67-factorb(hindii酶切验证)；3为pcdna-gp67-pce(hindiii酶切验证)。
56.2、重组产物转染表达宿主：
57.当哺乳动物细胞hek293培养密度达到2*106/ml时，且存活率达到95％以上，方可进行转染实验。其中，2*106/ml细胞数量需要2μg质粒(质粒为上述步骤1获得的pcdna-gp67-factorc、pcdna-gp67-factorb或pcdna-gp67-pce)，且转染试剂pei是质粒质量的3倍；
58.取两只ep管，分别加入0.5ml无血清培养基，其中一只加入总质量为20μg质粒，另外一只加入60μg转染试剂，分别充分混匀后；将含有转染试剂的液体缓慢加入到含有质粒的ep管中，并室温静置10～15min，形成转染试剂-质粒复合物；
59.将上述1ml转染试剂-质粒复合物均匀滴入到含有细胞的培养皿中，轻轻晃动培养皿，让复合物分散均匀。在37℃，5％co2培养箱中孵育6～18h，去除复合物培养液，更换新的培养液，继续培养。培养96h后，收集细胞上清液。由此，可表明基因重组表达的c因子、b因子和pce因子是可由细胞内分泌到细胞外，进入到细胞上清液中。
60.3、factorc、factorb和pce蛋白的分离纯化
61.使用his-tag亲和层析柱进行分离纯化，将上述步骤2获得的细胞上清液先进行4℃，3000g离心5min，收集上清液；先用5倍柱体积的无内毒素纯水洗涤镍柱，除去20％乙醇；再用10倍柱体积的buffer平衡镍柱；上清液流经已平衡过的镍柱；用10倍柱体积洗脱液进行洗脱，收集蛋白洗脱液，并进行sds-page分析，sds-page结果如图4显示。在图4-a中，1为factorb，2为pce；图4-b中，1为factorc。
62.实施例2内毒素的检测
63.1、动态浊度法
64.动态光度法测定仪器的程序及模板设定，以鲎试验微生物检测系统elx808iulalxh为例：温度设定：孵育温度37℃；振板设定：中速、振板5秒；动力学参数设定：读板时长120分，读板间隔30秒，检测建议波长630nm。
65.内毒素标准溶液配置
66.60eu细菌内毒素标准品1瓶，加入1ml细菌内毒素检查用水，置漩涡混匀器上剧烈震摇15分钟。将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释为5eu/ml的内毒素溶液。将5eu/ml内毒素标准品溶液依次梯度稀释、配置成0.5eu/ml、0.05eu/ml、0.005eu/ml，各个浓度内毒素标准品稀释液配制时，均应在漩涡混匀器上混匀至少1分钟。
67.天然鲎试剂溶解按照标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻混匀使鲎试剂完全溶液。
68.实验操作：
69.预热鲎试验微生物检测系统elx808iulalxh，设置检测温度为37℃。
70.取无热原微孔板，在相应孔中加入细菌内毒素检查用水(作为阴性对照)、内毒素标准品溶液或供试品溶液等各100μl，分别重复3个试验，每个孔加入100μl鲎试剂。
71.数据处理
72.设定启动od，软件自动线性回归计算出结果。
73.实验结果如图5所示：动态浊度法检测内毒素，再2小时后获得r2》0.9605的合格标准曲线。
74.2、c因子荧光法
75.荧光光度法测定仪器的程序及模板设定，以检测系统fluoroskan为例：温度设定：孵育温度37℃；振板设定：中速、振板5秒；动力学参数设定：读板时长60分，读板间隔60秒，检测建议激发波长390nm和发射波长460nm；
76.内毒素标准溶液配置
77.60eu细菌内毒素标准品1瓶，加入1ml细菌内毒素检查用水，置漩涡混匀器上剧烈震摇15分钟。将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释为5eu/ml的内毒素溶液。将5eu/ml内毒素标准品溶液依次梯度稀释、配置成0.5eu/ml、0.05eu/ml、0.005eu/ml，各个浓度内毒素标准品稀释液配制时，均应在漩涡混匀器上混匀至少1分钟。
78.c因子混合液
79.反应缓冲环境buffer 45μl、细菌内毒素检查用水39μl，荧光底物香豆素10μl，纯化后的重组c因子(实施例1中由重组哺乳细胞hek293细胞表达的)6μl，轻轻混匀备用。
80.实验操作
81.预热荧光微孔板检测仪fluoroskan，设置检测温度为37℃。
82.取无热原微孔板，在相应孔中加入细菌内毒素检查用水(作为阴性对照)、内毒素标准品溶液或供试品溶液等各100μl，分别重复3个试验，每个孔加入100μlc因子混合液。
83.数据处理
84.软件自动线性回归计算出结果；
85.实验结果如图6所示：荧光法检测内毒素，1小时后获得r2》0.9605的合格标准曲线；表明哺乳细胞hek293表达的c因子具有与内毒素结合的活性，且被激活后的c因子能够与荧光底物发生反应。
86.3、c因子、b因子和pce因子荧光法
87.荧光光度法测定仪器的程序及模板设定，以荧光微孔板检测仪fluoroskan为例：
88.温度设定：孵育温度37℃；振板设定：中速、振板5秒；动力学参数设定：读板时长60分，读板间隔60秒，检测建议激发波长390nm和发射波长460nm。
89.内毒素标准溶液配置
90.60eu细菌内毒素标准品1瓶，加入1ml细菌内毒素检查用水，置漩涡混匀器上剧烈震摇15分钟。将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释为5eu/ml的内毒素溶液。将5eu/ml内毒素标准品溶液依次梯度稀释、配置成0.5eu/ml、0.05eu/ml、0.005eu/ml，各个浓度内毒素标准品稀释液配制时，均应在漩涡混匀器上混匀至少1分钟。
91.c因子、b因子和pce因子混合液
92.反应缓冲环境buffer 45μl、细菌内毒素检查用水39μl，荧光底物香豆素10μl，纯化后的重组c因子、重组b因子和重组pce因子(重组c因子、重组b因子和重组pce因子是实施例1中由重组哺乳细胞hek293细胞表达的)混合后6μl，轻轻混匀备用。
93.实验操作
94.预热荧光微孔板检测仪fluoroskan，设置检测温度为37℃。
95.取无热原微孔板，在相应孔中加入细菌内毒素检查用水(作为阴性对照)、内毒素标准品溶液或供试品溶液等各100μl，分别重复3个试验，每个孔加入100μlc因子、b因子和pce因子混合液。
96.数据处理
97.软件自动线性回归计算出结果；
98.实验结果如图7所示：荧光法检测内毒素，在0.5小时后获得r2》0.9605的合格标准曲线；表明哺乳细胞hek293表达的c因子具有与内毒素结合的活性，且被激活后的c因子能够与荧光底物发生反应，并且加入哺乳细胞hek293表达的b因子和pce因子有促进c因子和内毒素结合，增大c因子被激活的概率，从而缩短检测所需要的时间。
99.4、c因子、b因子和pce因子荧光法
100.荧光光度法测定仪器的程序及模板设定，以荧光微孔板检测仪fluoroskan为例：
101.温度设定：孵育温度37℃；振板设定：中速、振板5秒；动力学参数设定：读板时长60分，读板间隔60秒，检测建议激发波长390nm和发射波长460nm。
102.内毒素标准溶液配置
103.60eu细菌内毒素标准品1瓶，加入1ml细菌内毒素检查用水，置漩涡混匀器上剧烈震摇15分钟。将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释为5eu/ml的内毒素溶液。将5eu/ml内毒素标准品溶液依次梯度稀释、配置成0.5eu/ml、0.05eu/ml、0.005eu/ml，各个浓度内毒素标准品稀释液配制时，均应在漩涡混匀器上混匀至少1分钟。
104.c因子、b因子和pce因子混合液
105.反应缓冲环境buffer 45μl、细菌内毒素检查用水39μl，荧光底物香豆素10μl，纯化后的重组c因子、重组b因子和重组pce因子(c因子是由哺乳动物细胞hek293细胞表达的，b因子和pce因子是昆虫细胞sf9表达的)混合后6μl，轻轻混匀备用。
106.实验操作
107.预热荧光微孔板检测仪fluoroskan，设置检测温度为37℃。
108.取无热原微孔板，在相应孔中加入细菌内毒素检查用水(作为阴性对照)、内毒素标准品溶液或供试品溶液等各100μl，分别重复3个试验，每个孔加入100μlc因子、b因子和pce因子混合液。
109.数据处理
110.软件自动线性回归计算出结果；
111.实验结果如图8所示：荧光法检测内毒素，在1小时后获得r2》0.9605的合格标准曲线；表明哺乳动物细胞hek293细胞表达的c因子具有与内毒素结合的活性，且被激活后的c因子能够与荧光底物发生反应，然而加入昆虫细胞表达的b因子和pce因子与直接加入哺乳动物细胞hek293细胞表达的b因子和pce因子相比，其检测时间更长，灵敏度更低。
112.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可
以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
113.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。