一种利用多孔聚合物分离材料从鱼籽多肽中分离纯化具有改善记忆功能的多肽的方法

1.本发明属于天然产物分离纯化技术领域，具体涉及一种利用多孔聚合物分离材料从鱼籽多肽中分离纯化具有改善记忆功能的多肽的方法。


背景技术：

2.多孔有机聚合物材料是一种内部具有交联网状结构的高分子聚合物材料，其具有比表面积、孔径以及粒径可调和表面易修饰等优点，并且具有操作简单等优点，被广泛地应用于天然小分子以及生物活性分子的分离纯化。
3.鱼籽是鱼类在加工过程中一种重要的副产物，其富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、钙、铁、维生素、胆固醇等营养物质。鱼籽多肽是鱼籽蛋白经蛋白酶水解后得到的多肽混合物，是一种生物活性肽，研究表明，鱼籽多肽具有降血压、抗氧化、抗菌、改善记忆以及增强免疫等生物活性。
4.目前，海洋生物活性肽的分离纯化主要是利用膜过滤法，如申请号为cn202110410087.x的中国发明专利提供了一种具有抗氧化和增强免疫功能的鳕鱼皮胶原蛋白肽及其制备方法，是将鳕鱼皮经过胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解，再利用胰蛋白酶进行酶解，酶解液经过膜过滤，再利用sephadexg-15凝胶柱及rp-hplc反相高效液相色谱进行分离得到具有抗氧化和增强免疫功能的鳕鱼皮胶原蛋白肽。申请号为cn202010239844.7的中国发明专利提供了一种从鱼籽中制备的改善记忆功能的多肽，是将鱼籽进行匀浆，再加入胰蛋白酶和胶原蛋白酶进行酶解，离心去上清液后再进行膜过滤，得到具有改善记忆功能的鱼籽多肽。但是该方法得到的具有改善记忆功能的多肽含量低、导致使用的时候需要量大、作用效果不佳。因此，分离纯化具有高含量改善记忆功能的多肽是急需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种利用多孔聚合物分离材料从鱼籽多肽中分离纯化具有改善记忆功能的多肽的方法，是以鱼籽为原料，多孔聚合物为分离材料，得到具有改善记忆功能的多肽。
6.本发明所提供的方法，包括如下的步骤：
7.1)鱼籽多肽的制备：将鱼籽粉碎匀浆，后利用胰蛋白酶和和胶原蛋白酶进行酶解，得到酶解液，离心，取上清液冻干得鱼籽多肽；
8.所述鱼籽为海洋鱼类的鱼籽，如黄花鱼、马鲛鱼、鮟鱇鱼或希鲮鱼等；
9.2)鱼籽多肽上样液制备：取鱼籽多肽配制成适当浓度的鱼籽多肽溶液；
10.所述配制鱼籽多肽的溶剂为去离子水或者10％-90％的乙醇水溶液，鱼籽多肽的浓度为50-500mg
·
ml-1
；
11.3)多孔聚合物分离材料分离纯化：
12.将多孔聚合物材料首先利用湿法装柱，去离子水洗至无醇味，将配制好的鱼籽多
肽溶液上样，控制一定流速，收集流出液；最后利用不同浓度的乙醇洗脱分离柱，合并乙醇洗脱部分，分别将收集的流出液及乙醇部分烘干得具有改善记忆功能的鱼籽多肽；
13.所述多孔聚合物材料为多孔有机聚合物材料，如聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯类、聚苯乙烯类、天然高分子类等，并且多孔聚合物材料粒径为5-100μm，孔径为2-100nm；
14.所述上样流速为0.1-5bv
·
h-1
；不同浓度的乙醇为10％-95％。
15.本发明的方法得到的具有改善记忆功能的鱼籽多肽含量更高，更好的改善记忆的效果，并且操作简单、易规模化制备。
附图说明
16.图1多孔聚合物材料纯化前鱼籽多肽hyzdt色谱图；
17.图2多孔聚合物材料纯化后鱼籽多肽hyzdt-1色谱图；
具体实施方式
18.下面通过具体实例对本发明的利用多孔聚合物分离材料从鱼籽多肽中分离纯化具有改善记忆功能的多肽的方法作进一步说明。
19.实施例1：制备黄花鱼来源的鱼籽多肽
20.(1)称取黄花鱼干鱼籽50g，加入500ml蒸馏水，利用转速为12000r
·
min-1
高速剪切机剪切匀浆30min，向上述匀浆液中加入5.0g胰蛋白酶和胶原蛋白酶组合酶，50℃酶解5h，每隔30min搅拌一次，酶解结束后加热至90℃灭酶，离心取上清液后，真空冷冻干燥得鱼籽多肽hyzdt，液相色谱图见图1；
21.(2)取2g冻干的鱼籽多肽，用去离子水配制成50mg ml-1
的溶液；
22.(3)粒径为10μm、平均孔径为30nm的交联聚甲基丙烯酸酯分离介质湿法装柱，后用去离子水洗至无醇味，以1bv
·
h-1
上样，收集流出液，真空冷冻干燥得hyzdt-1，液相色谱图见图2，得率为32％；最后分别用40％和95％的乙醇洗脱，合并洗脱液，真空冷冻干燥。
23.实施例2：制备取希鲮鱼来源的鱼籽多肽
24.(1)称取希鲮鱼干鱼籽50g，加入500ml蒸馏水，利用转速为12000r
·
min-1
高速剪切机剪切匀浆30min，向上述匀浆液中加入5.0g胰蛋白酶和胶原蛋白酶组合酶，50℃酶解5h，每隔30min搅拌一次，酶解结束后加热至90℃灭酶，离心取上清液后，真空冷冻干燥得鱼籽多肽xyzdt；
25.(2)取2g冻干的鱼籽多肽，用10％乙醇溶液配制成50mg ml-1
的溶液；
26.(3)粒径为30μm、平均孔径为10nm的交联聚苯乙烯-二乙烯基苯分离介质湿法装柱，后用去离子水洗至无醇味，以2bv
·
h-1
上样，收集流出液，真空冷冻干燥得xyzdt-1，得率为31％；最后分别用60％和95％的乙醇洗脱，合并洗脱液，真空冷冻干燥。
27.实施例3：制备马鲛鱼来源的鱼籽多肽
28.(1)称取马鲛鱼干鱼籽50g，加入500ml蒸馏水，利用转速为12000r
·
min-1
高速剪切机剪切匀浆30min，向上述匀浆液中加入5.0g胰蛋白酶和胶原蛋白酶组合酶，50℃酶解5h，每隔30min搅拌一次，酶解结束后加热至90℃灭酶，离心取上清液后，真空冷冻干燥得鱼籽多肽myzdt；
29.(2)取4g冻干的鱼籽多肽，用10％乙醇溶液配制成200mg ml-1
的溶液；
30.(3)粒径为40μm、平均孔径为50nm的交联聚甲基丙烯酸甲酯分离介质湿法装柱，后用去离子水洗至无醇味，以1bv
·
h-1
上样，收集流出液，真空冷冻干燥得myzdt-1，得率为35％；最后分别用50％和95％的乙醇洗脱，合并洗脱液，真空冷冻干燥。
31.实施例4鱼籽功能肽对东莨菪碱致记忆障碍大鼠逃避潜伏期和跳台次数的影响
32.利用实施例1中所得鱼籽多肽进行改善记忆实验，跳台实验表明：模型组大鼠逃避潜伏期较对照组均明显缩短，跳台错误次数均增加；hyzdt低剂量组与模型组比较，逃避潜伏期显著大于模型组(p《0.05)，高、中剂量组逃避潜伏期大于模型组，但无统计学意义；hyzdt-1高、中和低剂量组与模型组比较，逃避潜伏期均显著大于模型组(p《0.05)。hyzdt高剂量组与模型组比较，跳台错误次数小于模型组(p《0.05)，hyzdt中、低剂量组跳台错误次数也小于模型组，但无统计学意义；hyzdt-1高、低剂量组与模型组比较，跳台错误次数均小于模型组，而hyzdt-1中剂量组跳台错误次数也小于模型组，但无统计学意义。
33.表1：鱼籽功能肽对东莨菪碱致记忆障碍大鼠逃避潜伏期和跳台次数的影响
[0034][0035]
注：与模型组(东莨菪碱)比较，*代表p《005
[0036]
以上实验结果表明，治疗组均能够提高东莨菪碱致记忆障碍大鼠的记忆能力。hyzdt和hyzdt-1低剂量相比，hyzdt-1低剂量逃避潜伏期时间明显高于hyzdt低剂量组，而跳台错误次数明显低于hyzdt低剂量组，表明在同样剂量的前提下，hyzdt-1具有更好的改善东莨菪碱致记忆障碍大鼠的记忆能力的效果，即经过多孔聚合物材料分离纯化之后，具有改善记忆功能的多肽含量增加，多孔聚合物材料能够分离纯化具有改善记忆功能的鱼籽多肽。