一种粪产碱菌菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及环境工程领域微生物方向领域，本发明具体涉及一种粪产碱菌菌株。
2.本发明还涉及一种粪产碱菌菌株的应用。


背景技术：

3.随着经济的不断发展，城市化进程的不断推进，市政污水处理厂、石油炼化污水场、垃圾转运站、排水泵站、食品加工厂、养殖场、制药厂、油漆喷涂场等行业和领域产生的恶臭废气已成为影响人们正常生活的一个重要因素。恶臭废气指一切刺激嗅觉器官引起人们不愉快及损坏生活环境的气体，主要包括含硫化合物、含氮化合物、卤素及其衍生物、烃类、含氧的有机物、有机酸等。
4.市政污水处理厂排放的恶臭气体成分主要包括硫化氢、氨气、甲硫醇、二甲二硫、三甲胺等。吸收法、吸附法、焚烧法、冷凝法、植物液喷淋法、催化氧化法、离子法、生物法是几种除臭常用方法。市政污水厂气体、炼化污水场恶臭去除主要采用生物类方法。
5.生物除臭法一般经过三个步骤：（1）废气中的臭气分子由气相进入液相，溶解入生物膜表面的液膜中；（2）溶解到水中的臭气分子进一步扩散到生物膜表面，接着被微生物代谢分解；（3）进入微生物细胞的臭气分子被代谢分解，排除无机小分子物质和离子等，从而净化空气。
6.微生物除臭则是利用微生物的方法进行除臭，去除废气中氨气的菌株主要有假单胞菌（pseudomonas adaceae），枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）等，去除硫化氢的微生物有脱氮硫杆菌（thiobacillusdenitrificans），氧化硫硫杆菌（thiobacillusthiooxidans）等。而关于粪产碱菌去除硫化氢和氨气目前还未发现过多相关的报道。


技术实现要素：

7.为解决上述背景技术中的问题，本发明提供一种粪产碱菌菌株及其应用，粪产碱菌属产碱杆菌科，可解决目前环境废气废水中硫化氢，氨气所产生的臭气气体，给人们生活带来困扰的问题。
8.本发明提供如下技术方案：本发明的一种粪产碱菌菌株（alcaligenes faecalis），粪产碱菌名称为除臭菌rtl-05，于2021年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmcc no.23957，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
9.除臭菌rtl-05的dna序列如seq id no：1所示。
10.该菌株经过18 h后就能在lb培养基上生长到最大浓度3
×
10
10 cfu / ml，菌株在30-40 ℃，ph 4-8，次氯酸钠0 mg/l-5 mg/l的条件下正常生长。一种粪产碱菌菌株在生物
除臭方面的应用。一种粪产碱菌菌株用于生物除臭装置。除臭装置中活菌总浓度为1
×
10
9 cfu/ml。
11.所述的粪产碱菌菌株呈现典型的粪产碱菌菌落形态，菌落为湿润、隆起、乳白色、边缘整齐。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）本发明从不同样本中分离、筛选到高效去除硫化氢和氨气的优势粪产碱菌菌种rtl-05，经过驯化成高效稳定的菌株，经过试验，该菌株经过18h后就能在lb培养基上生长到最大浓度3
×
10
10 cfu / ml，菌株在30-40 ℃，ph 4-8，次氯酸钠0 mg/l-5 mg/l的条件下正常生长。接种到废水中，36h对水中的硫化氢去除率可达95%以上，对废水中氨的去除率可达80%。对废气中甲硫醇和苯乙烯的去除率可达50%，该菌种不仅可应用于氨气和硫化氢等常见恶臭气体的去除，还可以应用于甲硫醇，苯乙烯等有机废气的去除。
13.（2）以该菌株吸附后制成的生物除臭装置，经过实际运行，30天后去除率可达到85%，连续运行2个月，去除效果稳定，说明制成的生物除臭装置能很好地抵御废气的冲击，实现生物除臭的应用。
14.（3）本发明提供的粪产碱菌菌活力高，适应性强，不仅能够用于废水中硫化氢和氨气的去除，还能有效去除部分vocs，是可应用到除臭环保领域的高效除臭菌株。
附图说明
15.图1是除臭菌株rtl-05在lb中36小时生长曲线图。
16.图2是除臭菌株rtl-05不同温度下的有效活菌数。
17.图3是除臭菌株rtl-05不同ph条件下的有效活菌数。
18.图4是本发明的除臭菌株rtl-05的菌落形态图。
19.图5是5mg/l的浓度范围内的次氯酸钠对菌株rtl-05生长无明显影响图。
20.图6是实验室中除臭菌株rtl-05对氨气的去除率图。
21.图7是实验室中除臭菌株rtl-05对硫化氢的去除率图。
22.图8是实验室中除臭菌株rtl-05对甲硫醇的去除率图。
23.图9是实验室中除臭菌株rtl-05对苯乙烯的去除率图。
24.图10 是除臭菌株rtl-05应用到生物土壤除臭装置中对氨气的去除效果图。
25.图11 是除臭菌株rtl-05应用到生物土壤除臭装置中对硫化氢的去除效果图。
具体实施方式
26.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.本发明采用除臭菌株对废水中氨气、硫化氢、甲硫醇、苯乙烯的去除率作为评价标准。
28.实施例1本实施例是对除臭菌株rtl-05的筛选与鉴定：
1.培养以下试验用培养基在制备过程中均在121℃灭菌20 min。
29.luria-bertani培养基（lb）：胰蛋白胨10.0 g，氯化钠（nacl）10.0 g，酵母提取物5.0 g，琼脂粉15.0 g，加蒸馏水至1000 ml，ph=7.4，121℃下灭菌20 min。
30.牛肉膏蛋白胨培养基（na）：牛肉膏3.0 g，氯化钠（nacl）5.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂粉15.0 g，加蒸馏水至1000 ml，ph=7.5
±
0.1，121℃下灭菌20 min。
31.含氨富集培养基：蔗糖5.0 g，蛋白胨2.0g，磷酸二氢钾（kh2po4）2.0 g，硫酸镁（mgso4·
7h2o）0.5 g，氯化钠（nacl）2.0 g，硫酸锌（znso4）0.05g，硫酸亚铁（feso4）0.04 g，氨水5.0 ml（过滤除菌，灭菌后加入），涂布、纯化时加入琼脂粉15.0 g，加蒸馏水至1000 ml，ph=7.0，121℃下灭菌20 min。
32.异养硝化培养基: 柠檬酸三钠（c6h5na3o7·
2h2o）5.0 g，硫酸铵（(nh4)2so4）0.45 g，磷酸氢二钾（k2hpo4）0.25 g，硫酸铁（feso4·
7h2o）0.0025 g，氯化钠（nacl）0.125 g，硫酸镁（mgso4·
7h2o）0.06 g，硫酸锰（mnso4·
h2o）0.001 g，琼脂粉15.0 g，加蒸馏水至1000 ml，ph=7.0，121℃下灭菌20min。
33.含硫富集培养基：氯化铵（nh4cl）2.0g，氯化镁（mgcl2）0.5g，磷酸氢二钾（k2hpo4·
3h2o）3.0 g，硫化钠（na2s
·
9h2o）10.0 g（过滤除菌，灭菌后加入），氯化钙（cacl2·
6h2o）0.2 g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000 ml，ph=6.1
±
0.1，121℃下灭菌20 min。
34.含硫纯化培养基：氯化铵（nh4cl）2.0g，氯化镁（mgcl2）0.5 g，磷酸氢二钾（k2hpo4·
3h2o）3.0 g，硫代硫酸钠（na2s2o3·
5h2o）10.0 g，氯化钙（cacl2·
6h2o）0.2 g，琼脂粉15.0g，加蒸馏水至1000 ml，ph=6.1
±
0.1，121℃下灭菌20 min。
35.降解硫化物培养基：硫化钠（na2s
·
9h2o）0.1g，氯化铵（nh4cl）0.4g，氯化镁（mgcl2）0.2g，磷酸氢二钾（k2hpo4·
3h2o）2.0 g，碳酸钠（na2co3）0.4g，加蒸馏水至1000 ml，ph=6.1
±
0.1，121 ℃下灭菌20 min。
36.柠檬酸盐培养基：磷酸氢二钾（k2hpo4·
3h2o）1.0 g，氯化钠（nacl）5.0g，磷酸二氢铵（(nh4)h2po4）1.0 g，柠檬酸钠2.0g，硫酸镁（mgso4·
7h2o）0.2g，加蒸馏水至1000ml，加热搅拌溶解上述各溶质，ph=7.0。
37.2.脱氨功能菌的初筛：量取25 ml蒸馏水于250 ml三角瓶中，加入10颗玻璃珠，121℃高压灭菌20 min，冷却至室温后，加入10 g污水处理厂污泥样品，将三角瓶置于28℃、180 r/min的恒温摇床震荡培养，打碎混匀1-2 h，使污泥中的细菌游离出来，再用移液枪取5 ml震荡后的培养液转移至100 ml含氨富集培养基中，并在培养基中加入1%的氨水（由于氨水易挥发，需过滤除菌），再次将三角瓶置于28℃、180 r/min的恒温振摇床中震荡培养，培养基出现混浊时，再用移液枪在超净工作台中取5ml，转接到相同的含氨富集培养基中，转接三次后通过稀释涂板法在琼脂平板上分离功能菌，取100μl培养液加入到900μl的无菌水中，相当于稀释10倍，以此类推，分别稀释到10-4
、10-5
、10-6
，取这三个梯度浓度的稀释液100 μl均匀涂布于含氨纯化培养基的琼脂平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中培养。待菌落长出，挑取形态大小外观不同的单个菌落，再次于含氨纯化培养基的琼脂平板上三区划线，待菌落长出后再将三区划线的单菌落再次在含氨纯化培养基的琼脂平板上三区划线，如此反复三次，得到的则为纯化的菌株。
38.3.脱硫功能菌的分离与初筛：与脱氨功能菌的初筛相似，采用富集法。量取25 ml蒸馏水于250 ml三角瓶中，加入10颗玻璃珠，121℃高压灭菌20 min，冷却至室温后，加入10g污水处理厂污泥样品，将三角瓶置于28℃、180 r/min的恒温摇床震荡培养，打碎混匀1-2 h，使污泥中的细菌游离出来，再用移液枪取5 ml震荡后的培养液转移至100 ml含硫富集培养基中，并在培养基中加入1%的硫化钠（由于硫化钠易分解，也需过滤除菌），再次将三角瓶置于28℃、180 r/min的恒温振摇床中震荡培养，培养基出现混浊时，再用移液枪在超净工作台中取5ml，转接到相同的含氨富集培养基中，转接三次后通过稀释涂板法在琼脂平板上分离功能菌，取100 μl培养液加入到900μl的无菌水中，相当于稀释10倍，以此类推，分别稀释到10-4
、10-5
、10-6
，取这三个梯度浓度的稀释液100 μl均匀涂布于含硫纯化培养基的琼脂平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中培养。待菌落长出，挑取形态大小外观不同的单个菌落，再次于含硫纯化培养基的琼脂平板上三区划线，待菌落长出后再将三区划线的单菌落再次在含硫纯化培养基的琼脂平板上三区划线，如此反复三次，得到的则为纯化的菌株。
39.4.脱氨菌株的复筛：脱氨菌株的复筛是用纳氏试剂比色法来筛选脱氨能力强的菌株。
40.待测菌株为含氨富集培养基富集分离出的纯化菌株，从固体琼脂平板上挑各菌株的单菌落转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于恒温摇床中过夜培养，培养条件为28℃、180 r/min，以获得到新鲜种子液，再用移液枪取种子液按5%的接种量转接于异养硝化培养基中，置于恒温摇床中180r/min、28℃培养24h，间隔一定时间取菌液，于离心机12000 r/min离心2 min，取上清液用纳氏试剂比色法显色后，在波长420 nm下使用分光光度计测定溶液中氨氮的含量，同时以不加菌的培养基（ck）作为对照至于同样条件下，测定ck中氨氮含量，将样品与ck对比计算即可得到培养基中氨氮的脱除率。
41.测定样品时，分别取适量菌液离心后的上清液于比色管中，加无氨水补足至标线，先加入0.2 ml酒石酸钾纳溶液，并在振荡器上混匀。再加入0.3 ml纳氏试剂溶液，再次在震荡器上充分混匀。静置10 min后，在波长420 nm处，用光程10 mm比色皿测定吸光度，并以无氨水为参比。由测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，得到校准吸光值，绘制以氨氮含量（mg）对校正吸光度的标准曲线。同时以无氨水代替水样，做空白测定，校准样品的吸光值。由测得的样品的吸光度减去空白对照的吸光度后，从标准曲线上查得氨氮量（mg）后，按取样体积计算出培养基中的氨氮量，对比各菌液和对照ck中的氨氮量，计算出培养基中氨的脱除率，从而比较各菌株的脱氨能力，从中选出脱氨效果好的菌株进行下一步实验。
42.5.脱硫菌株的复筛：脱硫菌株的复筛是用亚甲基蓝比色法来筛选脱硫能力强的菌株。
43.与测定脱氨功能相似，待测菌株为含氨富集培养基富集分离出的纯化菌株，从固体琼脂平板上挑各菌株的单菌落转接于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于恒温摇床中过夜培养，培养条件为28℃、180 r/min，以获得到新鲜种子液，再用移液枪取种子液按5％的接种量转接于硫化钠降解培养基中，置于恒温摇床中180 r/min、28℃培养24h，间隔一定时间取菌液，于离心机12000 r/min离心2 min，取上清液用亚甲基蓝比色法显色后，在波长665 nm下测定溶液中硫化物的含量，每个处理设置3个重复。测定培养液上清中硫化物含量，置于10 ml比色管中，加无二氧化碳水至8 ml，加1 ml对氨基二甲基苯胺溶液，盖紧后上下颠
倒一次，轻微混匀。不可以剧烈震荡，然后加入200 μl硫酸铁铵溶液，立即在振荡器上震荡混匀，静置10 min后，以水为参比，在665 nm处测量吸光值，并以无二氧化碳水的空白管为对比进行校正。
44.取适量上清液于比色管中，加水稀释至8 ml，按标准曲线显色方法进行显色，加1 ml对氨基二甲基苯胺溶液，盖紧后上下颠倒一次，轻微混匀。不可以剧烈震荡，然后加入200 μl硫酸铁铵溶液，立即在振荡器上震荡混匀，静置10 min后，以水为参比，在665 nm处测量吸光值，并以无二氧化碳水的空白管为对比进行校正。以标准曲线为依据，从中计算出硫化物的含量，并将实验样本和空白对照样本进行比较，去除空白对照样本的硫化物值所得的即为脱硫菌株分解代谢硫化物的量。根据去除能力的大小进行菌株的筛选比较，以获得较强脱硫率的菌株。最终得到一株脱硫脱氮能力强的菌株rtl-05。
45.6.菌株鉴定采用16srna进行测序，结果显示菌株rtl-05为粪产碱菌，该菌株外形为短杆状，菌落表面光滑、湿润、乳白色、边缘整齐。其菌落形态图如图4所示。7.稳定性测试菌株rtl-05在lb培养基中稳定生长，6h时进入到对数生长期，20 h时进入稳定期，24h后可达到生长的最大浓度，菌株适应期较短，菌种生长曲线如图1所示。菌株rtl-05能在30-40℃，ph 4-8，次氯酸钠0 mg/l-5 mg/l的条件下正常生长，结果如图2、图3、图5所示。
46.实施例2本实施例应用菌株rtl-05进行模拟废水中的生物除臭。
47.具体过程为：（1）将培养24 h的rtl-05菌液加入含20 mg/l的含氨富集培养基中，摇床震荡培养，每6h取样测溶液中氨浓度，测定方法同实施例1。氨气去除效果如图6所示。
48.（2）将培养24 h的rtl-05菌液加入含20 mg/l的含硫富集培养基中，摇床震荡培养，每6h取样测溶液中硫化物浓度，测定方法同实施例1。硫化氢去除效果如图7所示。
49.（3）将培养24 h的rtl-05菌液加入含20 mg/l甲硫醇的lb培养基中，摇床震荡培养，每12h取样测溶液中甲硫醇浓度，因为甲硫醇是易挥发性物质，采用气相色谱进行分析，在气相色谱的检测时，采用顶空自动进样器进样，保证样品检测的准确性。甲硫醇去除效果如图8所示。
50.（4）将培养24 h的rtl-05菌液加入含10 mg/l苯乙烯的lb培养基中，摇床震荡培养，8h、12h、16h、20h、24h、36h取样测溶液中苯乙烯浓度，因为苯乙烯是易挥发性物质，采用气相色谱进行分析，在气相色谱的检测时，采用顶空自动进样器进样，保证样品检测的准确性。苯乙烯去除效果如图9所示。
51.实施例3本实施例应用菌株rtl-05进行全过程除臭。
52.除臭废气样品为南京市城东污水处理厂未被处理的污水所产生的有机废气，实验条件是在现场小型的生物土壤除臭装置中添加rtl-05微生物菌剂，并在不同的时间测定污水中的氨和硫化氢的含量，计算去除率。
53.具体过程为：1、将培养24 h的rtl-05菌液加入到生物滤柱中，搅拌均匀，对照组为不加菌的生
物滤柱处理组。
54.2、每隔3天测定装置进气口，出气口的氨和硫化氢的含量，并计算去除率，结果如图10和图11所示，结果表明菌株rtl-05接种到在生物土壤装置中后，15 d后对废气中氨的去除率接近80%，硫化氢去除率达到85%。且装置运行40 d后，对废气中氨的去除率稳定在95%，硫化氢去除率稳定在90%。
55.3、在火山石等固体载体上吸附后通气30小时后对废气中的氨和硫化氢的去除率达到100%，说明该菌种活力高，适应性强，可广泛用于水体和气体中硫化氢和氨的生物处理过程中，连续运行2个月，去除效果稳定，其全过程除臭效果如图10和图11所示，说明制成的生物除臭装置能很好地抵御废气的冲击，实现生物除臭的应用。
56.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。