一种副干酪乳杆菌的特异性筛选及分离方法与流程

1.本发明属于微生物分离领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌的特异性筛选及分离方法。


背景技术：

[0002]“益生菌”一词最早出现于1974年，其功能就正如世界卫生组织在2002年提出的定义，即“活的微生物，食用足够的量可带来健康益处”。如今益生菌被加入到各种产品中，如含牛乳型饮料、发酵型酸奶制品、婴儿配方奶粉，以帮助消费者平衡肠道菌群环境、调节免疫、控制体重等，成为全球常见的食品补充剂。越来越多文献表明，传统的益生菌-副干酪乳杆菌有良好的安全性，补充此菌能减少肥胖与免疫疾病的风险。分离此菌的方法大多是采取大量样本后随机选取获得，试验周期长且繁琐，因此如何快速分离副干酪乳杆菌则成为其关键的技术突破点，这是本领域研究者有待解决的问题。


技术实现要素：

[0003]
本发明所要解决的技术问题是提供一种副干酪乳杆菌的特异性筛选及分离方法，以解决副干酪乳杆菌分离速度慢的难题。
[0004]
本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0005]
本发明提供了一种副干酪乳杆菌的特异性筛选及分离方法，包括以下步骤：
[0006]
(1)收集待测样品并梯度稀释接种于乳酸菌液体培养基中形成悬浊液，并进行热裂解，得裂解液；
[0007]
(2)取步骤(1)所述裂解液作为模板，利用副干酪乳杆菌特异性引物进行pcr扩增反应，得pcr产物；
[0008]
(3)对pcr产物进行凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，有明显条带，则确定为副干酪乳杆菌的阳性样本；
[0009]
(4)选取阳性样本接种于乳酸菌半固体培养基上厌氧培养出单菌落，取半固体培养基的单菌落，重复两次三区划线接种于乳酸菌固体培养基上厌氧培养；
[0010]
(5)选取固体培养基上的菌落通过16s rrna通用引物进行测序验证，分离出副干酪乳杆菌。
[0011]
优选的，步骤(2)中，所述副干酪乳杆菌特异性引物序列如seq id no.1～2所示。
[0012]
优选的，步骤(1)中，所述乳酸菌液体培养基为改良mrs培养基；步骤(4)中，所述乳酸菌半固体培养基为添加0.6％-0.8％琼脂粉的改良mrs培养基；所述乳酸菌固体培养基为添加1.5％-2％琼脂粉的改良mrs培养基。
[0013]
优选的，步骤(4)中，所述乳酸菌半固体培养基中，厌氧培养的温度为37℃，培养时间为3天；所述乳酸菌固体培养基上厌氧培养的温度为37℃，培养时间为2天。
[0014]
优选的，步骤(3)中，所述pcr扩增反应体系为：premix taq
tm
12.5μl，ddh2o 10.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl和样本模板1μl，漩涡混匀后离心，然后可以置于pcr反应
仪器上进行反应；
[0015]
所述pcr扩增反应的反应条件为：98℃变性10秒，68℃退火30秒，72℃延伸30秒，共计25个循环。
[0016]
优选的，步骤(5)中，所述16s rrna通用引物序列如seq id no.3～4所示。
[0017]
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
[0018]
本发明的副干酪乳杆菌的优化分离方法十分直观且便捷。本发明针对副干酪乳杆菌的特异性，设计出副干酪乳杆菌的特异性引物，通过pcr扩增反应作为辅助，经过2-3次纯化，最后能直观的在固体培养基上筛选出副干酪乳杆菌单菌落，为大规模样品中副干酪乳杆菌的筛选提供一种行之有效的全新方法。
附图说明
[0019]
图1为人体粪便样本pcr扩增结果的凝胶成像图，m表示：dnamarker；数字表示：对人体粪便样本进行连续10倍梯度稀释的次数。
具体实施方式
[0020]
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述,但并不因此将本发明限制在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
[0021]
实施例1人体粪便中副干酪乳杆菌阳性样本的筛选实验
[0022]
步骤一，乳酸菌液体、固体、半固体培养基的配制
[0023]
乳酸菌液体培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母浸粉4g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温801g、蒸馏水1l，ph值3.5
±
0.2；
[0024]
乳酸菌半固体培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母浸粉4g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温801g、琼脂8g、蒸馏水1l，ph值5.0
±
0.2；
[0025]
乳酸菌固体培养基：蛋白胨10g、牛肉浸粉8g、酵母浸粉4g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温801g、琼脂20g、蒸馏水1l，ph值5.0
±
0.2。
[0026]
步骤二，粪便样本的收集
[0027]
收集3-10岁正常人粪便样本1-5克置于装有除过氧气的、乳酸菌液体培养基厌氧管中，使用针筒将粪便悬浊液进行10倍梯度稀释，由10-1
稀释到10-8
，并将每个稀释梯度置于培养箱中培养10小时。培养结束后漩涡震荡厌氧管中的菌悬浊液，分别吸取200μl菌悬液置于无菌的1.5ml的ep管中。分别将装有200μl菌悬液的ep管置于金属浴中进行热裂解，70℃放置30min，并依此为模板进行后续的pcr实验。
[0028]
步骤三，pcr扩增反应实验，按照以下体系进行配制反应液
[0029]
上游引物f1序列：tcgaacgagttctcgttgatgatc(seq id no.1)
[0030]
下游引物f2序列：tttcccagtttccgatgcgcttc(seq id no.2)
[0031][0032][0033]
pcr扩增反应条件为：98℃变性10秒，68℃退火30秒，72℃延伸30秒，共计25个循环。
[0034]
吸取5μl产物进行电泳，120v，30min。进行凝胶成像有明显条带即视为阳性，确定人体粪便中副干酪乳杆菌的阳性样本(如图1所示)。
[0035]
实施例2从阳性样本中进行副干酪乳杆菌菌株的分离实验
[0036]
步骤一，选取阳性厌氧管作为样本，使用10ul接种环接种到乳酸菌半固体培养基上，对每个平板进行3-4区划线，重复划线3-4个平板
[0037]
步骤二，37℃厌氧培养2-3天后，选取独立存在平板两侧侧或夹杂在小菌落中间的形状轻微不规则椭圆、湿润、黄色或白色的单克隆进行重复接种到乳酸菌固体培养基上，纯化2-3次。
[0038]
步骤三，通过16s rrna通用引物进行测序验证
[0039]
上游细菌通用引物1:1492r：ggttaccttgttacgactt(seq id no.3)
[0040]
下游细菌通用引物2:27f：agagtttgatcctggctca(seq id no.4)
[0041][0042]
pcr扩增反应条件为：98℃变性10秒，60℃退火30秒，72℃延伸1.5min，共计30个循环。
[0043]
步骤四，pcr扩增产物凝胶成像：
[0044]
吸取5μl pcr扩增产物进行凝胶电泳，120v，30min。凝胶成像结果，若在1500bp左右有明显、单一的条带即视为阳性。通过测序后进行ncbi库对比验证，即分离出副干酪乳杆菌。
[0045]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。