一种MRC-5细胞复苏培养液以及复苏方法与流程

一种mrc-5细胞复苏培养液以及复苏方法
技术领域
1.本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种mrc-5细胞复苏培养液以及复苏方法。


背景技术：

2.细胞冷冻作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已深入广泛的应用。研究人员经常需要冷冻细胞并保存，以供后续实验或临床使用。传统的低温冷冻保存技术是将二甲基亚砜(dmso)和血清中加入细胞混悬液后放入冻存管中，于-80℃冰箱慢慢冷冻后，将冻存管置于液氮中保存，使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，需要时快速解冻。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄增、交换和运输某些细胞。
3.细胞冻存时加入保护剂终浓度5％-15％的dmso，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用
″
慢冻快融
″
的方法能较好地保证细胞存活。然而复苏过程中冻存液里的dmso和复苏后细胞培养基里的残留dmso往往对细胞会有一定的毒性作用，抑制细胞增殖，影响复苏后细胞的活性和后续试验的开展。
4.为降低dmso对细胞的毒性，传统的细胞冻存后复苏，均采用细胞融化后离心沉淀细胞去除上清冻存液，再进行接种培养基进行培养。申请人研究中发现，离心过程中容易造成细胞冻存管破裂，从而造成细胞污染，影响细胞扩增。因细胞复苏后在有抗生素的培养基里贴壁生长，如果菌含量不高细胞连续传几代也未必能发现细菌污染，只有在换成无抗生素培养液里才能发现有无细菌污染。这个过程需要20-30天，从而影响整个生产或研发进度。另外，离心处理这一步操作，在操作过程中也是造成细胞污染的一个关键点。然而基于离心去除冻存剂简单易操作，能显著降低dmso的含量，以及从离心处理后到发现细菌污染已经经过许多处理步骤并不容易将细菌污染直接归因于离心处理步骤等原因，目前还未有尝试取代离心处理步骤进行细胞复苏的相关研究和报道。


技术实现要素：

5.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种人胚肺成纤维细胞（mrc-5细胞）复苏培养液以及复苏方法，可以将通过含有dmso冻存液冻存的mrc-5细胞融化后直接接种至mrc-5细胞复苏培养液培养，省略了离心处理步骤，避免细胞污染，节约时间成本，且细胞贴壁率高于传统细胞复苏方法的细胞贴壁率，细胞质量高。
6.为此，本发明提供了如下的技术方案：本发明提供了一种mrc-5细胞复苏培养液，包括如下体积份的组分：基础培养基，6.5-7.7体积份；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.2-0.3体积份；
质量体积比3%必需氨基酸，0.1-0.2体积份；胎牛血清，2-3体积份。
7.可选的，所述的mrc-5细胞复苏培养液，包括如下体积份的组分：基础培养基，7.7体积份；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.2体积份；质量体积比3%必需氨基酸，0.1体积份；胎牛血清，2体积份。
8.可选的，所述基础培养基包括日水培养基、dmem培养基或mem培养基；或所述必需氨基酸包括l-谷氨酰胺。
9.本发明提供了所述的mrc-5细胞复苏培养液在细胞复苏中的用途。
10.可选的，在mrc-5细胞复苏中的用途。
11.本发明提供了一种mrc-5细胞复苏的方法，包括利用所述的mrc-5细胞复苏培养液培养融化的mrc-5细胞。
12.可选的，所述培养条件为37
±
1℃培养16-18小时。
13.可选的，包括如下步骤：将冻存的mrc-5细胞融化，备用；将融化的mrc-5细胞接种至mrc-5细胞复苏培养液中培养。
14.可选的，所述mrc-5细胞融化步骤中，将从液氮中取出的mrc-5细胞冻存管放入经过预热的灭菌水中进行解冻。
15.可选的，还包括将复苏后的细胞进行换液培养，换液培养基包括如下体积份的组分：基础培养基，8.5-9.2体积份；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.2-0.3体积份；质量体积比3%必需氨基酸，0.1-0.2体积份；胎牛血清，0.5-1体积份。
16.可选的，所述换液培养基包括如下体积份的组分：基础培养基，8.7体积份；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.2体积份；质量体积比3%必需氨基酸，0.1体积份；胎牛血清，1体积份。
17.可选的，所述基础培养基包括日水培养基、dmem培养基或mem培养基；或所述必需氨基酸包括l-谷氨酰胺。
18.本发明技术方案，具有如下优点：1. 本发明提供的一种mrc-5细胞复苏培养液，包括如下体积份的组分：基础培养基，6.5-7.7体积份；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.2-0.3体积份；质量体积比3%必需氨基酸，0.1-0.2体积份；胎牛血清，2-3体积份；上述mrc-5细胞复苏培养液可以显著降低保存液中的dmso对mrc-5细胞的毒性影响，可以将通过含有dmso冻存液冻存的mrc-5细胞融化后直接接种至mrc-5细胞复苏培养液培养，省略了离心处理步骤，避免细胞污染，节约时间成本，且细胞贴壁率高于传统细胞复苏方法的细胞贴壁率，细胞质量高，利于后续细胞扩增。
19.2.本发明提供的一种mrc-5细胞复苏方法，包括将冻存的mrc-5细胞融化，备用；将融化的mrc-5细胞接种至mrc-5细胞复苏培养液中培养；上述方法省略了离心处理步骤，避免细胞污染，节约时间成本。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1是本发明实验例1中采用实施例7的mrc-5细胞复苏方法中换液前的细胞贴壁情况；图2是本发明实验例1中采用实施例7的mrc-5细胞复苏方法中换液后的细胞贴壁情况；图3是本发明实验例1中采用对比例1的mrc-5细胞复苏方法中换液前的细胞贴壁情况；图4是本发明实验例1中采用对比例1的mrc-5细胞复苏方法中换液后的细胞贴壁情况；图5是本发明实验例2中的时间与细胞增殖数曲线。
具体实施方式
22.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
23.实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
24.下述实施例中日水培养基为市售产品，其成分为（9.4g/l）：氧化钠6800.0mg，氧化钾400.0mg，氧化钙200.0mg，硫酸镁93.5mg，磷酸二氢钠115.0mg，葡萄糖1000.0mg，l精氨酸盐酸盐126.0mg，l-胱氨酸二盐酸盐(一水)31.4mg，l-酪氨酸36.0mg，l-组氨酸盐酸盐（一水）42.0mg，l-异亮氨酸52.0mg，l-亮氨酸52.0mg，l-赖氨酸盐酸盐73.0mg，l-甲硫氨酸15.0mg，l-苯丙氨酸32.0mg，l-苏氨酸48.0mg，l-色氨酸10.0mg，l-缬氨酸46.0mg，琥珀酸（丁二酸）75.0mg，琥珀酸钠（丁二酸钠），六水，100.0mg，酒石酸氢胆碱（重酒石酸胆碱）1.8mg，叶酸1.0mg，肌醇2.0mg，烟酰胺（维生素b3，尼克酰胺）1.0mg，泛酸钙1.0mg，盐酸吡哆醛1.0mg，核黄素（维生素b2）0.1mg，盐酸硫铵（维生素b1）1.0mg，生物素（维生素b7，辅酶r）0.02mg。
25.下述实施例中的mrc-5细胞冻存管中使用的保存液中dmso的浓度为10%(v/v)。
26.下述实施例中的胎牛血清购自gibico。
27.实施例1
本实施例提供了一种mrc-5细胞复苏培养液，配方为：日水培养基，7.7ml；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.2ml；质量体积比3%l-谷氨酰胺，0.1ml；胎牛血清，2ml。
28.按照上述配方量取日水培养基、质量体积比7.5%碳酸氢钠、质量体积比3%l-谷氨酰胺和胎牛血清，混合，制备得到mrc-5细胞复苏培养液。
29.实施例2本实施例提供了一种mrc-5细胞复苏培养液，配方为：dmem培养基，6.5ml；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.3ml；质量体积比3%l-谷氨酰胺，0.2ml；胎牛血清，3ml。
30.按照上述配方量取dmem培养基、质量体积比7.5%碳酸氢钠、质量体积比3%l-谷氨酰胺和胎牛血清，混合，制备得到mrc-5细胞复苏培养液。
31.实施例3本实施例提供了一种mrc-5细胞复苏培养液，配方为：mem培养基，7ml；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.3ml；质量体积比3%l-谷氨酰胺，0.2ml；胎牛血清，2.5ml。
32.按照上述配方量取mem培养基、质量体积比7.5%碳酸氢钠、质量体积比3%l-谷氨酰胺和胎牛血清，混合，制备得到mrc-5细胞复苏培养液。
33.实施例4本实施例提供了一种mrc-5细胞换液培养基，配方为：日水培养基，8.7ml；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.2ml；质量体积比3%l-谷氨酰胺，0.1ml；胎牛血清，1ml。
34.按照上述配方量取日水培养基、质量体积比7.5%碳酸氢钠、质量体积比3%l-谷氨酰胺和胎牛血清，混合，制备得到mrc-5细胞换液培养基。
35.实施例5本实施例提供了一种mrc-5细胞换液培养基，配方为：dmem培养基，8.5ml；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.3ml；质量体积比3%l-谷氨酰胺，0.2ml；胎牛血清，1ml。
36.按照上述配方量取dmem培养基、质量体积比7.5%碳酸氢钠、质量体积比3%l-谷氨酰胺和胎牛血清，混合，制备得到mrc-5细胞换液培养基。
37.实施例6本实施例提供了一种mrc-5细胞换液培养基，配方为：mem培养基，9.2ml；质量体积比7.5%碳酸氢钠，0.2ml；质量体积比3%l-谷氨酰胺，0.1ml；胎牛血清，0.5ml。
38.按照上述配方量取mem培养基、质量体积比7.5%碳酸氢钠、质量体积比3%l-谷氨酰胺和胎牛血清，混合，制备得到mrc-5细胞换液培养基。
39.实施例7本实施例提供了一种mrc-5细胞复苏方法，包括如下步骤：（1）细胞融化细胞复苏前将灭菌后注射水放入37℃培养箱进行预热2小时，备用；从液氮罐中取出mrc-5细胞的冻存管，迅速放入灭菌后注射水中，晃动使其快速解冻，此过程一般在2-3分钟完成。
40.（2）细胞复苏从注射水中取出mrc-5细胞的冻存管，在所述冻存管表面喷洒75%酒精消毒，放入层流罩下，开启冻存管，用5ml吸管吸取细胞悬液(2.0
×
106/ml)（1ml），加入实施例1的mrc-5细胞复苏培养液中，轻轻吹打混匀，放置37℃培养箱培养17小时。
41.（3）细胞换液在37℃培养箱培养17小时后取出，在显微镜下观察细胞贴壁情况，需贴壁率≥90%，然后将培养瓶放入层流罩下，吸去细胞培养上清，加入实施例4的换液培养基（37℃预热），置37℃继续培养。
42.实施例8本实施例提供了一种mrc-5细胞复苏方法，包括如下步骤：（1）细胞融化细胞复苏前将灭菌后注射水放入37℃培养箱进行预热2小时，备用；从液氮罐中取出mrc-5细胞的冻存管，迅速放入灭菌后注射水中，晃动使其快速解冻，此过程一般在2-3分钟完成。
43.（2）细胞复苏从注射水中取出mrc-5细胞的冻存管，在所述冻存管表面喷洒75%酒精消毒，放入层流罩下，开启冻存管，用5ml吸管吸取细胞悬液(2.0
×
106/ml)（1ml），加入实施例2的mrc-5细胞复苏培养液中，轻轻吹打混匀，放置37
±
1℃培养箱培养16小时。
44.（3）细胞换液在37℃培养箱培养16小时后取出，在显微镜下观察细胞贴壁情况，需贴壁率≥90%，然后将培养瓶放入层流下，吸去细胞培养上清，加入实施例5的换液培养基（37℃预热），置37℃继续培养。
45.实施例9本实施例提供了一种mrc-5细胞复苏方法，包括如下步骤：（1）细胞融化
细胞复苏前将灭菌后注射水放入37℃培养箱进行预热2小时，备用；从液氮罐中取出mrc-5细胞的冻存管，迅速放入灭菌后注射水中，晃动使其快速解冻，此过程一般在2-3分钟完成。
46.（2）细胞复苏从注射水中取出mrc-5细胞的冻存管，在所述冻存管表面喷洒75%酒精消毒，放入层流罩下，开启冻存管，用5ml吸管吸取细胞悬液(2.0
×
106/ml)（1ml），加入实施例3的mrc-5细胞复苏培养液中，轻轻吹打混匀，放置37
±
1℃培养箱培养18小时。
47.（3）细胞换液在37℃培养箱培养18小时后取出，在显微镜下观察细胞贴壁情况，需贴壁率≥90%，然后将培养瓶放入层流罩下，吸去细胞培养上清，加入实施例6的换液培养基（37℃预热），置37℃继续培养。
48.对比例1本实施例提供了一种传统的mrc-5细胞复苏方法，包括如下步骤：（1）细胞融化细胞复苏前将灭菌后注射水放入37℃培养箱进行预热2小时，备用；从液氮罐中取出mrc-5细胞的冻存管，迅速放入灭菌后注射水中，晃动使其快速解冻，此过程一般在2-3分钟完成。
49.（2）离心沉淀细胞从注射水中取出mrc-5细胞的冻存管，进行离心沉淀细胞（2000rpm，5min）。
50.（3）细胞复苏将冻存管表面喷洒75%酒精消毒，放入层流罩下，开启冻存管，吸弃上清液，将沉淀的细胞接种至普通的mrc-5细胞复苏培养基（采用实施例4中的换液培养基）中，放置37℃培养箱培养17小时。
51.（4）细胞换液在37℃培养箱培养17小时后取出，在显微镜下观察细胞贴壁情况，需贴壁率≥90%，然后将培养瓶放入层流下，吸去细胞培养上清，加入换液用培养液（采用实施例4中的换液培养基）（37℃预热），置37℃继续培养。
52.实验例1 细胞贴壁率实验本实验例复苏6支mrc-5细胞冻存管（细胞冻存前每个细胞冻存管的细胞浓度为2.0
×
106个/ml），其中3支细胞冻存管采用对比例1的方法复苏，即离心去保护剂后接种至mrc-5换液培养基中培养，另3支细胞冻存管采用实施例7的方法复苏，即融化后的细胞直接接种至本发明的mrc-5细胞复苏培养液进行培养。
53.（1）将两种复苏方法的细胞（各3支）在细胞复苏步骤中培养至16-18小时后，分别用pbs进行洗涤去除上清死细胞和未贴壁细胞，对贴壁细胞计数。
54.计算细胞贴壁率：细胞贴壁率=贴壁后细胞数/复苏时细胞数
×
100%（2）分别在换液前和换液后，将两种复苏方法的细胞在显微镜下观察细胞贴壁情况并拍照记录。
55.实验结果如下：（1）细胞贴壁率结果如下表1。
56.表1细胞贴壁率结果由上表1可知，本发明的mrc-5细胞复苏方法细胞贴壁率高于传统细胞复苏方法，本发明的mrc-5细胞复苏方法中，细胞能够快速贴壁，说明细胞状态良好，筛选更优势的细胞完成细胞扩增，增强细胞质量。
57.（2）换液前和换液后细胞贴壁情况如图1-图4所示，由图中可以直观的观察到，本发明的mrc-5细胞复苏方法细胞贴壁率高于传统细胞复苏方法，细胞质量强。
58.实验例2、细胞增殖率实验沿用实验例1中的细胞，对两种复苏方式的细胞（换液培养后的细胞）进行传代1次（胰酶消化分装成t25细胞瓶），消化后计数第0天的细胞数量，此后每2天消化1瓶细胞并计数，连续计数12天。绘制时间与细胞增殖数曲线，结果如下表2和图5。
59.表2细胞计数
由上表2和图5可以看出，本发明的改良细胞复苏方式细胞增殖率优于传统细胞复苏方式。
60.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。