核酸扩增反应器的制作方法

1.本实用新型涉及核酸检测(dna或rna)耗材的技术领域，具体涉及一种核酸扩增反应器。


背景技术：

2.核酸检测作为一种具有高灵敏度及特异性的方法，目前已经广泛应用于许多领域，例如疾病诊断，食品安全，传染病防治等。用简单方式对特定核酸序列进行检测，可以赋予现场护理(point-of-care)诊断和现场病原体检测更大的价值。
3.pcr(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点，是能将微量的dna大幅增加。然而，pcr作为经典的核酸检测方法，其固有的变性-复性-延伸循环，要求其必须需要热循环仪设备作为支撑，同时因为气溶胶污染问题，专业实验室也作为必须要条件。其中pcr延展技术平台，特别是定量pcr(qpcr)方法，是最广泛使用的病原体检测方法，并且被认为是新的金标准测试。qpcr提供短得多的样品到结果(sample-to-result)的时间(3到5小时)。然而，尽管qpcr被广泛接受，但它因依赖标准参考物质(标准曲线)进行定量而受到限制。不可靠和不一致的商业标准参考物质也可能影响qpcr定量的准确度。此外，qpcr易于受到由环境样品中自然存在的物质(例如，重金属和有机质)引起的抑制，从而导致靶定量不准确或假阴性结果。因而极大地限制了pcr在床旁快速诊断(poct)和现场快速检测等领域的应用。与qpcr相比，最近的数字pcr技术已被证明是用于环境样品中的微生物病原体检测的更稳健的解决方案。数字pcr基于分区(partitioning)和泊松统计，因此，不需要比较外部定量标准来对未知浓度的样品定量。然而，将数字pcr方法实施于使用点应用(point-of-use application)可能是挑战性的。这是因为数字pcr需要昂贵的仪器(即bio-rad液滴数字pcr)、设备齐全的实验室环境和训练有素的技术人员来进行测定。这些因素严重限制数字pcr在资源有限背景下的可及性和应用。
4.为了克服这些缺点，一大类等温核酸扩增的新方法大量出现，其中lamp是最受关注也是最有应有前景的一种方法。
5.环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代pcr核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换dna聚合酶(bst dna polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109～10
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倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。lamp作为一种分子生物学检测技术，具有高特异性、高敏感性、简单、便捷及成本低的特点，已广泛用于临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片。
6.因此，lamp被期望用于检测微生物的快速、简化、低成本的测定，以在集中式实验室之外，例如，在需要对资源有限的地方的环境水进行现场使用点测试的情况下提供分子测定。
7.lamp检测在等温条件下进行，等温条件可以维持在不同的仪器中，例如热循环仪和水浴。该设备使得能够通过加热装置内部的检测室来扩增样品的dna/cdna，以检测病原体。
8.等温扩增仪利用链置换型dna聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现109-1010倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。
9.目前已经有一些研究展示了用聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,pdms)制备的微反应器去做lamp反应，但pdms这种材料的固有属性是多孔、透气，这些属性对于细胞培养等工作是有利的，但是却不适合核酸扩增的应用，因为在这个微反应器中会有溶液的蒸发及气泡的产生。实际上，引起气溶胶污染的最常见的原因是扩增过程中气泡的爆裂，而这类气溶胶很容易冲破pdms微反应器的封合界面。此外，pdms很疏水，基于pdms的微加工往往在微观尺度上几何形状并不规则，这些都会导致在加样和加热的过程中产生气泡，这些气泡很可能会冲破对进样口、出样口或不同反应池之间所做的封闭。虽然有一些研究工作针对上述pdms的缺点，对原始的pdms进行了一些材料改性，意图提高它的不可渗透性及几何形状的规则性，但这无疑增加了制备的复杂性与成本。
10.在实际应用中以一种廉价、简单的装置高效地执行多种靶标的同时测，依旧是一种紧迫的需求。有工作将传统的pcr小管小型化集成到一个pdms芯片上去做多重扩增，但芯片的制作依然依赖于精密微加工。在最近几年，芯片上的液滴技术也被越来越多地用于核酸扩增，但是它们都需要复杂的流体控制系统，外设往往庞大且需要外部供电，因此从整体上来看，此类装置并没有真正地实现小型化。
11.因为基于扩增的核酸检测试剂及检测设备的局限性，导致目前检测中扩增操作也无法解决核酸或者其他待测样品的提取问题，扩增过程也需要多次开盖，尤其是通过八连管作为反应器时，且同样需要在专业的pcr实验室操作以避免污染，所以现有技术的核酸检测仍无法实现现场取样、现场检测，尤其是没有可实现直接加入样本后进行直接一次性完成反应的反应器，仍旧采用传统的八连管或者ep管，这是核酸检测无法很好的应用在poct以及病原微生物拓展应用的重要掣肘。


技术实现要素：

12.本实用新型要解决的技术问题就在于：针对现有技术存在的技术问题，本实用新型提供一种核酸扩增反应器，可对同一样本同时进行多项共检，且可实现整个核酸检测过程对检测条件基本无限制，无气溶胶污染
13.为解决上述技术问题，本实用新型提出的技术方案为：
14.一种核酸扩增反应器，所述反应器包括顺序连接的样本部、加样部和反应部，所述加样部位于样本部与反应部之间，反应前，样本部和反应部之间为独立密封状态，所述加样部为活塞结构，所述反应部中装有反应体系；反应部与样本部连接处设有微孔且所述微孔的孔径不大于样本液或样本保存液的毛细长度；在反应器密封状态下，加样部通过外力运动实现密封状态下样本液穿过微孔进入反应部内。
15.作为上述技术方案的进一步改进为：
16.上述方案中，优选地，所述加样部、样本部和反应部顺序连接，所述加样部和样本
部之间活动连接实现密封状态，所述样本部内预装有样本保存液；在反应器密封状态下，加样部通过外力向反应部方向运动实现密封状态下样本液穿过微孔压入反应部内。
17.上述方案中，优选地，所述加样部设有密封件，所述密封件通过外力在加样部的连接腔中运动实现在密封状态下样本液与反应液的混合。
18.上述方案中，优选地，所述样本部设有至少一个样本腔，所述反应部设有至少一个反应腔，所述样本腔和反应腔不直接连通。
19.上述方案中，优选地，所述样本部与加样部之间、所述反应部与加样部之间设有微孔，每个所述样本腔对应一个微孔，每个所述反应腔对应一个微孔。
20.上述方案中，优选地，所述加样部设有移动件，所述移动件设于加样部的连接腔内，所述移动件带动密封件在连接腔中移动，所述密封件设于移动件上。
21.上述方案中，优选地，所述加样部设有至少一个连通位，所述密封件成对布设，两个所述密封件之间构成一个连通位，一个所述连通位对应一个或一个以上的反应腔和一个样本腔。
22.上述方案中，优选地，所述移动件的横截面积小于加样部连接腔的直径，所述密封件与加样部的内壁过盈连接，使每个连接位独立密封。
23.上述方案中，优选地，所述密封件为橡胶件。
24.上述方案中，优选地，所述微孔的直径为0.3mm～1mm。
25.上述方案中，优选地，所述反应器还设有密封盖，所述样本腔和反应腔的进液口设置密封盖。
26.上述方案中，优选地，所述反应体系通过封隔层预埋在反应腔内，所述封隔层采用常温固态，加热后熔化为液态的材料。封隔材料熔化的温度匹配加热反应温度，且不会对扩增反应体系产生影响
27.本实用新型提供的核酸扩增反应器及其应用，与现有技术相比有以下优点：
28.(1)本技术的核酸扩增反应器，可以在扩增操作中将反应体系预加入，预加入的反应体系不仅避免了现场配置反应体系对环境的限制，简化了检测前的体系配置步骤，还能够保证检测的快速进行和简便使用。后续扩增操作仅需加入待测样本，达到扩增反应条件(如温度)后可直接反应，无需再次加液，故检测过程中反应器只需要一次开盖加入待测样本，且样本与反应体系中其它组分无接触，在反应过程中充分接触直接进行反应，无需再次开盖，就可实现整个核酸检测过程对检测条件基本无限制，无气溶胶污染，检测反应完成后通过处理反应器获得结果即可。
29.(2)本技术的核酸扩增反应器，反应器中微孔的孔径设置，即保证了在储存运输、待测样本加入等过程中样本液或样本保存液不进入反应腔内，也保证了在施加外力的情况下，样本液可以顺利进入反应腔中充分反应。
30.(3)本技术的核酸扩增反应器，封隔材料熔化温度匹配加热反应温度，且不会对扩增反应体系产生影响，加热后封层熔化，保证了在不开盖的情况下反应体系充分混合，熔化后的封隔材料由于密度小浮于反应体系之上，进一步行成了反应体系上的封层，对反应的充分进行提供了双重保证。
31.(4)本技术的核酸扩增反应器及其应用，针对公共卫生事件，可通过简易加热设备(乃至保温杯)配合本实用新型反应器实现，无需专业人士操作，结果清晰易判，适合目前国
内外各类医疗检测场景需求，尤其是相对落后地区，可使其分子诊断能力大幅提升。
附图说明
32.图1是本实用新型的结构示意图。
33.图中标号说明：
34.1、样本部；11、密封件；12、样本腔；2、加样部；21、移动件；22、连通位；3、反应部；31、反应腔；32、微孔；4、密封盖。
具体实施方式
35.下面结合实施例对本实用新型作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。
36.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
37.图1示出了本实用新型的核酸扩增反应器的一种实施方式，本实施例中，反应器的样本部1、加样部2、反应部3顺序连接，加样部2位于样本部1与反应部3之间，加样部2设有密封件11，密封件11通过外力在加样部2的连接腔中运动实现在密封状态下样本液与反应液的混合。
38.本实施例中，样本部1与加样部2之间、反应部3与加样部2之间设有微孔，每个样本腔12对应一个微孔，每个反应腔31对应一个微孔，微孔的直径为0.3mm～1mm，优选微孔的直径为0.5mm。一个密封件11可以同时封堵样本部1的微孔和反应腔31的微孔。反应部3设有至少一个反应位，密封件11成对布设，两个密封件11之间构成一个连通位22。
39.本实施例中，反应器为长方体型，反应腔31和样本腔12为圆孔，分别设有多个，反应腔31和样本腔12与微孔的连接处设为圆锥形。加样部2设有圆形的连接腔。实际应用时根据需求，一个样本腔12可以对应一个或者多个反应腔31，每个反应腔31埋设不同的反应液，连通位22对应设置，如果样本腔12和反应腔31是一对一布设，则两个密封件11就设置在一个样本腔12和一个反应腔31相应的位置；设一个样本腔12对应三个反应腔31，则两个密封件11围设的区域为三个反应腔31。
40.本实施例中，反应器的材料可以为玻璃或塑料制成。
41.本实施例中，加样部2设有移动件21，本实施例中移动件21为移动销，移动销的直径小于加样部2连接腔的直径，密封件11设于移动销上，移动销可以在连接腔内移动。
42.本实施例中，密封件11与加样部2的内壁过盈连接，密封件11选用耐高温的橡胶制成，制成非透明的颜色，便于观察连通位22。密封件11套设固定在移动销上，间隔布设。密封件11的厚度要大于微孔的直径，才能封堵密封件11两侧的微孔32。
43.本实施例中，反应器配设相应的凸起按件，凸起按件的直径略小于移动销端口处的直径。反应时，凸起按件推动移动销是移动销在连接腔移动，带动密封件11离开微孔处。连接腔两端设有限位阶梯或者凸起按件设有限位阶梯，用于移动时定位密封件11的位置。凸起按件可以单独设置，也可以设置于离心振动机上。
44.本实施例中，反应器还设有密封盖4，样本腔12和反应腔31设有从外部向其内部引入液体的进液口，进液口设置密封盖4，防止样本液或反应液漏出。
45.本实用新型核酸扩增反应器，在检测时包括以下步骤：
46.1)先确定密封件11封堵了两侧的微孔，即样本腔12、反应腔31和连接腔不连通，预先将反应液封存在反应腔31，并通过密封盖4封闭反应腔31；
47.2)将样本液注入样本腔12后，密封盖4封闭样本腔12；
48.3)将反应器放置于离心振动机上，凸起按件推动移动销移动，带动密封件11移动，使样本腔12和反应腔31通过连通位22连通，样本液和反应液并不会流入微孔；
49.4)通过离心振动机的离心振动使样本液穿过微孔、反应液穿过微孔，样本液和反应液混合后发生反应。
50.本实施例中，样本液包含在核酸扩增反应中用做模板核酸链的dna、基因组rna、mrna等。
51.反应液包含待检测核酸的引物、dna聚合酶和反应缓冲液中的一种或多种。可以每种反应液注入到一个反应腔31也可以将反应液混合后注入一个反应腔。一个连通位22可以对应多个反应腔，只需在一个样本腔12注入样本即可。
52.上述实施案例只是本实用新型的较佳实施例，并非对本实用新型作任何形式上的限制。虽然本实用新型已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本实用新型。因此，凡是未脱离本实用新型技术方案的内容，依据本实用新型技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本实用新型技术方案保护的范围内。