一种用于昆虫共生真菌单细胞分离培养的微流控芯片

1.本发明专利涉及微流控芯片技术领域，具体应用于昆虫共生真菌单细胞分离培养。


背景技术：

2.昆虫体内存在大量的共生真菌，这些共生真菌不但种类多样，同时在昆虫的生长、发育、繁殖、营养代谢、抗性变异以及免疫功能等生命活动中起着至关重要的作用。明确鉴定昆虫共生菌及其功能是研究共生菌与昆虫共生关系的关键。但由于技术局限性和昆虫共生真菌离体培养易污染的特性，进行研究工作需耗费大量人力、技术成本。
3.微流控，是一种精确控制和操控微尺度流体，尤其特指亚微米结构的技术，又称其为芯片实验室或微流控芯片技术。是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。由于微米级的结构，流体在微流控芯片中显示和产生了与宏观尺度不同的特殊性能，因此发展出独特的分析性能。同时还有着体积轻巧、使用样品及试剂量少、能耗低，且反应速度快、可大量平行处理及可即用即弃等优点。
4.市面上现有的微流控芯片、已申请专利的微流控芯片装置大多适用于检测方面，没有专门用于培养昆虫共生真菌的装置，且培养中可控变量少，难以满足实验所需。


技术实现要素：

5.针对现有产品和技术的不足，本发明提出一款可用于昆虫共生真菌单细胞分离培养的微流控芯片，集单细胞筛选、培养、分离、变温调控、便于对比实验等功能为一体，能够实现昆虫共生真菌的单细胞培养，过程快速便捷，可实时调控。
6.为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
7.一种用于昆虫共生真菌单细胞分离培养的微流控芯片，由上至下分为三层结构，依次为第一层pdms板、第二层pdms膜和第三层pdms板，所述第一层pdms板和第三层pdms板为聚二甲基硅氧烷pdms板，第二层pdms膜为聚二甲基硅氧烷pdms薄膜，相邻两层结构之间上下粘合且边缘重叠形成密封状态；
8.所述第一层pdms板上设有一总进样口、一总出样口、若干微腔室出样口和若干条装载有微腔室的培养液通道，若干条培养液通道的一端均与总进样口连接，另一端均与总出样口连接，每条培养液通道上均设有若干串联的微腔室；每个微腔室包括一直形的微腔室主通道、一半圆形的微腔室侧通道和一微腔室出样通道，所述侧通道的两端均与对应主通道连接，主通道上由进液侧往出液侧方向依次设有捕获通道、捕获腔和拦截通道，所述捕获通道、捕获腔和拦截通道均位于侧通道和主通道的两个连接处之间，所述拦截通道的内径小于捕获通道的内径，所述微腔室出样通道一端与捕获腔相连，另一端与一微腔室出样口相连；每条培养液通道上相邻两个微腔室的主通道依次串联，头部微腔室的主通道另一
端与总进样口相连，尾部微腔室的主通道另一端与总出样口相连；
9.所述第三层pdms板上设有若干用于通断微腔室出样通道的外气阀组，所述外气阀组与培养液通道一一对应，外气阀组可通断对应培养液通道上的所有微腔室出样通道，当外气阀组内通气时，第二层pdms膜受外气阀组充气膨胀挤压第一层pdms板内的微腔室出样通道，对应第一层pdms板上的微腔室出样通道被切断；当外气阀组内未通气时，对应第一层pdms板上的微腔室出样通道开启，第三层pdms板上设有供外气阀组内气体进出的外气阀组进气口和外气阀组出气口，第一层pdms板和第二层pdms膜上均设有与外气阀组进气口位置对应的进气连接孔以及与外气阀组出气口位置对应的出气连接孔；
10.所述第三层pdms板上设有若干用于通断微腔室侧通道的内气阀组，所述内气阀组与培养液通道一一对应，内气阀组可通断对应培养液通道上的所有微腔室侧通道，当内气阀组内通气时，第二层pdms膜受内气阀组充气膨胀挤压第一层pdms板内的微腔室侧通道，对应第一层pdms板上的微腔室侧通道被切断；当内气阀组内未通气时，对应第一层pdms板上的微腔室侧通道开启，第三层pdms板上设有供内气阀组内气体进出的内气阀组进气口和内气阀组出气口，第一层pdms板和第二层pdms膜上均设有与内气阀组进气口位置对应的进气连接孔以及与内气阀组出气口位置对应的出气连接孔。
11.优选地，所述第一层pdms板上的培养液通道是采取光刻技术刻画在pdms板表面的孔道。
12.优选地，所述培养液通道为一条长为100-1000um，直径为5-50um，由总进样口下方位置通向总出样口的微流孔道。
13.优选地，所述培养液通道的数量为2条。
14.优选地，所述微腔室出样通道为一条直径为5-50um，由微腔室通向微腔室出样口下方位置的微流孔道。
15.优选地，所述微腔室为陷入第一层pdms板内部的凹槽。
16.优选地，所述微腔室的数量为10个。
17.优选地，所述微腔室内，主通道直径为5-50um；侧通道直径为5-50um；捕获通道直径为2-25um；捕获腔直径为5-50um；拦截通道直径为2-5um。
18.优选地，所述总进样口、微腔室出样口、总出样口、外气阀组进气口、内气阀组进气口、外气阀组出气口、内气阀组出气口的直径均与100微升移液枪头中部直径相匹配。
19.正常情况下，主通道和侧通道流阻大小相差不大，当微小于通道的细胞被捕获在捕获通道时，主通道被堵，流阻增大，溶液从侧通道流出至下一个捕获区，依次捕获，实现单细胞分离的功能。单细胞被分离在微腔室中可继续进行培养。
20.本发明的芯片可克服昆虫共生真菌难分离、易污染、培养条件难摸索、通量低等困难，实现昆虫共生真菌单细胞级别分离、高通量培养及细胞提取，操作方便快捷，分离效率高，通量大，能耗少，可循环使用。
附图说明
21.图1本发明的芯片分层结构示意图。
22.图2本发明中微腔室的结构示意图。
23.1-第一层pdms板，2-第二层pdms膜，3-第三层pdms板，4-总进样口，5-微腔室出样
口，6-培养液通道，7-总出样口，8-外气阀组进气口，9-内气阀组进气口，10-外气阀组，11-外气阀组出气口，12-内气阀组出气口，13-内气阀组，14-微腔室主通道，15-微腔室侧通道，16-微腔室捕获通道，17-微腔室出样通道，18-捕获腔，19-微腔室拦截通道，a-微腔室。
具体实施方式
24.下面结合附图和具体实施方案对本发明做进一步的描述。
25.如图1所示，一种用于昆虫共生真菌单细胞分离培养的微流控芯片，由上至下分为三层结构，依次为第一层pdms板1、第二层pdms膜2和第三层pdms板3，所述第一层pdms板1和第三层pdms板3为聚二甲基硅氧烷pdms板，第二层pdms膜2为聚二甲基硅氧烷pdms薄膜，相邻两层结构之间上下粘合且边缘重叠形成密封状态。
26.所述第一层pdms板1上设有1个总进样口4、1个总出样口7、10个微腔室出样口5和2条装载有微腔室a的培养液通道6，2条培养液通道的一端均与总进样口4连接，另一端均与总出样口7连接；所述第一层pdms板1上的培养液通道是采取光刻技术刻画在pdms板表面的孔道，该渠道为一条长为100-1000um，直径为5-50um，由总进样口4下方位置通向总出样口7的微流孔道，其在本发明中设置的数量为2条，其数量可随实际需要增减。
27.每条培养液通道上均设有5个串联的微腔室a，其数量可随实际需要增减。每个微腔室a包括1条直形的微腔室主通道14、1条半圆形的微腔室侧通道15和1条微腔室出样通道17，所述侧通道15的两端均与对应主通道14连接；每条培养液通道6上相邻两个微腔室a的主通道14依次串联，头部微腔室a的主通道14另一端与总进样口4相连，尾部微腔室a的主通道14另一端与总出样口7相连，主通道14上由进液侧往出液侧方向依次设有捕获通道16、捕获腔18和拦截通道19，所述捕获通道16、捕获腔18和拦截通道19均位于侧通道15和主通道14的两个连接处之间，所述拦截通道19的内径小于捕获通道16的内径。
28.所述微腔室a内，主通道14直径为5-50um；侧通道15直径为5-50um；捕获通道16直径为2-25um；捕获腔18直径为5-50um；拦截通道19直径为2-5um。
29.所述微腔室出样通道17一端与捕获腔18相连，另一端与微腔室出样口5相连，所述微腔室出样通道17直径为5-50um，是由微腔室a通向微腔室出样口5下方位置的微流孔道。
30.所述第三层pdms板3上设有1组由2条气阀组合构成用于通断微腔室出样通道17的外气阀组10，所述外气阀组10与培养液通道6一一对应，外气阀组10可通断对应培养液通道6上的所有微腔室出样通道17，当外气阀组10内通气时，第二层pdms膜2受外气阀组10充气膨胀挤压第一层pdms板1内的微腔室出样通道17，对应第一层pdms板1上的微腔室出样通道17被切断；当外气阀组10内未通气时，对应第一层pdms板1上的微腔室出样通道17开启，第三层pdms板3上设有供外气阀组内气体进出的外气阀组进气口8和外气阀组出气口11，第一层pdms板1和第二层pdms膜2上均设有与外气阀组进气口8位置对应的进气连接孔以及与外气阀组出气口11位置对应的出气连接孔。
31.所述第三层pdms板3上设有1组由2条气阀组合构成用于通断微腔室侧通道15的内气阀组13，所述内气阀组13与培养液通道6一一对应，内气阀组13可通断对应培养液通道6上的所有微腔室侧通道15，当内气阀组13内通气时，第二层pdms膜2受内气阀组13充气膨胀挤压第一层pdms板1内的微腔室侧通道15，对应第一层pdms板1上的微腔室侧通道15被切断；当内气阀组13内未通气时，对应第一层pdms板1上的微腔室侧通道15开启，第三层pdms
板3上设有供内气阀组内气体进出的内气阀组进气口9和内气阀组出气口12，第一层pdms板1和第二层pdms膜2上均设有与内气阀组进气口9位置对应的进气连接孔以及与内气阀组出气口12位置对应的出气连接孔。
32.所述总进样口4、微腔室出样口5、总出样口7、外气阀组进气口8、内气阀组进气口9、外气阀组出气口11、内气阀组出气口12的直径均与100微升移液枪头中部直径相匹配。
33.所述培养腔为陷入第一层pdms板内部的凹槽，芯片整体底部配备一套自测恒温扩增加热模组，温控精度在1度以内，温度范围32-98度可调控，时间控制范围1-180小时，且具备开始提醒、结束提醒功能。
34.芯片制作采用光刻工艺，制作时使用光刻机，匀胶仪，烘箱等仪器设备。制造材料主要为pdms胶。
35.第一阶段高通量精确分选：开启外气阀组10，即微腔室出样口5及连接微腔室的出样通道17关闭；同时关闭内气阀组13，即微腔室侧通道15开启。通过总进样口4往芯片内部加入含有目标菌种的培养液进行分离筛选，正常情况下，微腔室主通道14和侧通道15流阻大小相差不大，当微小于通道的细胞被捕获通道16捕获送入捕获腔18，接着又被拦截通道19所拦截于捕获腔18内，此时主通道被堵，流阻增大，溶液从侧通道流出至下一个微腔室a，即可依次分离筛选捕获目标菌种细胞，多余的培养液及非目标菌种最后从总出样口7流出。
36.第二阶段目标细胞提取：停止进样，关闭外气阀组10，即微腔室出样口5及微腔室的出样通道17开启；同时开启内气阀组13，即微腔室侧通道15关闭。因侧通道15受压关闭带来压强差，又因此时通入不含任何菌种的纯净培养液，使存在于捕获腔18内的被分离出的目标菌种细胞进入微腔室的出样通道17，从而得以将目标菌种细胞分离提取出来。
37.本发明提供了用于分离单细胞培养昆虫共生真菌的微流控芯片，集细胞筛选、培养、分离、变温调控、便于对比实验等功能为一体，能够实现昆虫共生真菌的单细胞培养，过程快速便捷，可实时调控。该芯片主要依据目标菌的各项参数设计分离通道，在短时间内进行高通量快速筛选，并于稳定的环境中培养所筛选的目标菌种，使一些原本在技术上无法实现离体培养的细菌能够在离开寄生宿主的情况下单细胞培养，培养完成后还可取出鉴定。本发明不依赖其他的仪器设备，运行速度快，效率高，特异性强，操作简便。
38.应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。