一种高效降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的角质酶突变体及应用

1.本发明涉及一种高效降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的角质酶突变体及应用，属于环境科学领域。


背景技术：

2.聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)是塑料的一种，因其具有高机械强度、低透气性、重量轻、成本价格低等优点，目前已在全世界范围内得到了广泛的应用。大量pet废弃物因得不到有效回收、自然状态下难以降解，导致pet在全球生态体系中积累使得土地营养成分流失土壤板结，并且大量漂流在海洋上的塑料会对海洋生态系统造成毁灭性地打击。目前，填埋、焚烧、物化回收处理方式造成能源的浪费又对环境产生极其严重的影响。故生物降解被认为是控制塑料污染最有效的方法。
3.各种pet水解酶陆续被鉴定并证明能够在不同程度上降解pet，如ideonella sakaiensis的petase，植物堆肥中的宏基因组的lc角质酶，saccharomonora viridis ahk190的角质酶，thermomyces insolens的hic，及candida antarctica的脂肪酶b等。虽然部分鉴定的pet水解酶已显示具有相对较高的降解性，但其降解效果远达不到规模化降解要求。
4.2008年，chen等人对来源于嗜热假单胞菌的角质酶(thermobifida fusca cutinase)进行研究，它具有良好耐热性并能催化酯键水解，具有将pet降解为对苯二甲酸(tpa)和乙二醇(eg)的效果。尽管如此，该酶催化效率较低，因此需通过定点突变对该酶的结构进行改造，使其降解pet的效率得到提高，实现pet的高效生物降解。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服角质酶降解pet效率低的不足，提供了新的角质酶的突变体及应用。本发明合成了来源于thermobifida fusca能够水解pet的角质酶tfc并对其进行了表达纯化，通过研究tfc的结构后，针对其活性区参与底物相互作用的氨基酸进行突变，以增加酶对底物pet的活力。
6.本发明提供了角质酶突变体，所述突变体包含对应于seq id no:1所示多肽的第65位、第92位、第184位、第209位、第213位的取代；其中，
7.所述角质酶突变体与seq id no:1所示的第1到261位的多肽的具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽。
8.在一种实施方式中，
9.所述第65位的取代是用赖氨酸取代丙氨酸；
10.所述第92位的取代是用甘氨酸取代为谷氨酰胺；
11.所述第184位的取代是用丝氨酸取代组氨酸；
12.所述第209位的取代是用异亮氨酸取代苯丙氨酸；
13.所述第213位的取代是用赖氨酸取代异亮氨酸。
14.在一种实施方式中，所述的突变体是将seq id no:1所示多肽的第65位氨基酸由丙氨酸取代为赖氨酸，命名为tfc突变体m1(a65k)，其氨基酸序列如seq id no:2所示，其核苷酸序列如seq id no:12所示。
15.在一种实施方式中，所述的突变体是将seq id no:1所示多肽的第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，命名为tfc突变体m2(q92g)，其氨基酸序列如seq id no:3所示，其核苷酸序列如seq id no:13所示。
16.在一种实施方式中，所述的突变体是将seq id no:1所示多肽的第184位氨基酸由组氨酸取代为丝氨酸，命名为tfc突变体m3(h184s)，其氨基酸序列如seq id no:4所示，其核苷酸序列如seq id no:14所示。
17.在一种实施方式中，所述的突变体是将seq id no:1所示多肽的第209位氨基酸由苯丙氨酸取代为异亮氨酸，命名为tfc突变体m4(f209i)，其氨基酸序列如seq id no:5所示，其核苷酸序列如seq id no:15所示。
18.在一种实施方式中，所述的突变体是将seq id no:1所示多肽的第213位氨基酸由异亮氨酸取代为赖氨酸(i213k)，命名为tfc突变体m5(i213k)，其氨基酸序列如seq id no:6所示，其核苷酸序列如seq id no:16所示。
19.在一种实施方式中，所述的突变体是将seq id no:1所示多肽的第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，第184位氨基酸由组氨酸突变为丝氨酸，同时第209位氨基酸由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，命名为tfc突变体m6(q92g/h184s/f209i)，其氨基酸序列如seq id no:7所示，其核苷酸序列如seq id no:17所示。
20.在一种实施方式中，所述的突变体是将seq id no:1所示多肽的第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，第184位氨基酸由组氨酸取代为丝氨酸，第209位氨基酸由苯丙氨酸取代为异亮氨酸，同时第213位氨基酸由异亮氨酸取代为赖氨酸，命名为tfc突变体m7(q92g/h184s/f209i/i213k)，其氨基酸序列如seq id no:8所示，其核苷酸序列如seq id no:18所示。
21.在一种实施方式中，所述的突变体是将seq id no:1所示多肽的第65位氨基酸由丙氨酸取代为赖氨酸，第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，第184位氨基酸由组氨酸取代为丝氨酸，同时第209位氨基酸由苯丙氨酸取代为异亮氨酸，命名为tfc突变体m8(a65k/q92g/h184s/f209i)，其氨基酸序列如seq id no:9所示，其核苷酸序列如seq id no:19所示。
22.在一种实施方式中，所述的突变体是将seq id no:1所示多肽的第65位氨基酸由丙氨酸取代为赖氨酸，第92位氨基酸由谷甘酰胺取代为甘氨酸，第184位氨基酸由组氨酸取代为丝氨酸，第209位氨基酸由苯丙氨酸取代为异亮氨酸，同时第213位氨基酸由异亮氨酸取代为赖氨酸，命名为tfc突变体m9(a65k/q92g/h184s/f209i/i213k)，其氨基酸序列如seq id no:10所示，其核苷酸序列如seq id no:20所示。
23.本发明提供了编码所述突变体的多核苷酸。
24.本发明提供了包含权所述多核苷酸的核酸构建体、载体。
25.在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppic3k或ppic9k系列载体。
26.在一种实施方式中，所述载体为pet24a，将编码所述突变体的多核苷酸插入pet24a载体的多克隆酶切位点处。
27.本发明提供了表达所述突变体、或包含所述多核苷酸的宿主细胞。
28.在一种实施方式中，所述宿主细胞包括但不限于大肠杆、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母。
29.本发明提供了生产所述角质酶突变体的方法。
30.在一种实施方式中，所述方法包括：
31.a)在适合于表达所述变体的条件下培养本发明的宿主细胞；以及
32.b)任选地回收所述变体。
33.在一种实施方式中，所述a)是将所述宿主细胞在含有碳源、氮源和无机盐的培养基中培养。
34.在一种实施方式中，所述a)是将所述宿主细胞在lb培养基中在35～40℃、150～250rpm条件下培养至od
600
＝0.8
±
0.5，后添加终浓度为0.4mm的iptg，在20～30℃、150～250rpm下培养获得发酵液。
35.在一种实施方式中，所述b)是将发酵液离心并取上清液，得到粗酶液，将粗酶液在60℃热处理1h，去除其他杂蛋白，再经离心取上清，获得纯酶液。
36.本发明提供了含有所述角质酶突变体的产品。
37.在一种实施方式中，所述产品包括但不限于含有所述角质酶突变体的酶制剂或组合物。
38.在一种实施方式中，所述酶制剂或组合物中含有酶保护剂；所述保护剂包括酸碱调节剂、冻干保护剂。
39.本发明提供了一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯或含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的物质的方法，所述方法为向含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的体系中加入所述角质酶突变体进行反应。
40.在一种实施方式中，所述角质酶突变体的添加量不少于8000u/g底物；可选地，所述角质酶的添加量为8000～50000u/g底物。
41.在一种实施方式中，在ph8.0
±
0.5、50～60℃、150～250rpm下反应。
42.在一种实施方式中，反应时间不少于80h。
43.可选地，反应时间不少于96h。
44.本发明提供了所述突变体在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯或含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的物质中的应用。
45.在一种实施方式中，所述含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的物质包括矿泉水瓶、碳酸饮料瓶、保护膜等由聚对苯二甲酸乙二醇酯制成的物质。
46.定义或术语：
47.角质酶：术语“角质酶(cutinase)”是指如酶命名法所定义的ec3.1.1.74类中的酶。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定角质酶活性。在一方面，本发明的变体具有seq id no:1的多肽的角质酶活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％。
48.编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，所述多核苷酸直接规定了角质酶变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(例如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(例如taa、tag或tga)结束。编码序列可以为基因组dna、cdna、合成dna或其组合。
49.表达：术语“表达”包括涉及角质酶变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
50.表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状dna分子，所述分子包含编码本发明的角质酶变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
51.片段：术语“片段”意指在多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有角质酶活性。在一方面，片段含有seq id no:1的氨基酸1至331(即不包含酶原区序列长度)的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％。
52.宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
53.改善的降解性：术语“改善的降解性”意指与相对于亲本角质酶在降解pet或作用于酯键的效果有所改善的角质酶变体的特征。
54.分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关的一种或多种或全部天然存在的组分中去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加所述物质的量而修饰的任何物质(例如，编码所述物质的基因的多个拷贝；比与编码所述物质的基因天然相关的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
55.变体：术语“变体”意指具有角质酶活性的、在一个或多个(例如若干个)位置包含改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的变体具有seq id no:1的多肽氨基酸序列，并分别在第65位、第92位、第184位、第209位、第213位发生取代，所取代的氨基酸分别为赖氨酸(k)、甘氨酸(g)、丝氨酸(s)、异亮氨酸(i)、赖氨酸(k)。同时，在第1位前添加1个氨基酸(即生成-1位氨基酸)，添加氨基酸为天冬酰胺(d)。本发明的变体的角质酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。
56.m1(a65k)：在野生型的基础上，将第65位被取代为赖氨酸(k)。
57.m2(q92g)：在野生型的基础上，将第92位被取代为甘氨酸(g)。
58.m3(h184s)：在野生型的基础上，将第184位被取代为丝氨酸(s)。
59.m4(f209i)：在野生型的基础上，将第209位被取代为异亮氨酸(i)。
60.m5(i213k)：在野生型的基础上，将第213位被取代为赖氨酸(k)。
61.m6(q92g/h184s/f209i)：在野生型的基础上，将第92位、184位、209位分别被取代
为甘氨酸(g)、丝氨酸(s)、异亮氨酸(i)。
62.m7(q92g/h184s/f209i/i213k)：在野生型的基础上，将第92位、184位、209位、213位分别被取代为甘氨酸(g)、丝氨酸(s)、异亮氨酸(i)、赖氨酸(k)。
63.m8(a65k/q92g/h184s/f209i)：在野生型的基础上，将第65位、92位、184位、209位分别被取代为赖氨酸(k)、甘氨酸(g)、丝氨酸(s)、异亮氨酸(i)。
64.m9(a65k/q92g/h184s/f209i/i213k)：在野生型的基础上，将将第92位、184位、209位、213位分别被取代为赖氨酸(k)、甘氨酸(g)、丝氨酸(s)、异亮氨酸(i)、赖氨酸(k)。
65.在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编，采用了已接受的iupac单字母或三字母的氨基酸缩写。
66.取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。
67.本发明的角质酶，包含对应于seq id no:1所示序列的第65位的取代，取代成赖氨酸(k)；第92位的取代，取代成甘氨酸(g)；第184位的取代，取代成丝氨酸(s)；第209位的取代，取代成异亮氨酸(i)；第213位的取代，取代成赖氨酸(k)；其中，
68.i)所述角质酶与seq id no:1所示的第1到331位的多肽的具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的多肽；和/或
69.ii)所述角质酶是由以下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与seq id no:11所示的核苷酸1位至993位的成熟多肽编码序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性；
70.在一种实施例中，所述角质酶，第65位的取代，取代成赖氨酸(k)；
71.在一种实施例中，所述角质酶，第92位的取代，取代成甘氨酸(g)；
72.在一种实施例中，所述角质酶，第184位的取代，取代成丝氨酸(s)；
73.在一种实施例中，所述角质酶，第209位的取代，取代成异亮氨酸(i)；
74.在一种实施例中，所述角质酶，第183位的取代，取代成谷氨酸(e)；
75.在一种实施例中，所述角质酶，第213位的取代，取代成赖氨酸(k)。
76.本发明的有益效果：本发明通过对来源于thermobifida fusca来源角质酶tfc进行改造得到一系列突变体，所述突变体是在所述tfc的底物结合位点附近发生单点或多点突变，对其第65位、第92位、第184位、第209位、第213位发生突变，构建得到9种突变体。与野生型tfc相比，本发明所述9种tfc的突变体(m1-m9)在酶活、60℃下的半衰期有显著提升，并对降解pet的效率有了显著提升，具有良好的工业前景。
具体实施方式
77.下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
78.下述实施例中涉及的聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)塑料购置于goodfellow公司。对苯二甲酸乙二酯(bhet)、羟乙基对苯二甲酸酯(mhet)和对苯二甲酸(tpa)购自sigma公司。
79.下述实施例中涉及的检测方法如下：
80.下述实施例中涉及的大肠杆菌jm109以及大肠杆菌e.coli bl21(de3)购自takara-宝日医生物技术(北京)有限公司。
81.涉及的培养基如下：
82.lb固体培养基(g/l)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10、琼脂13，ph 7.0。
83.lb液体培养基(g/l)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10，ph 7.0。
84.蛋白浓度测定方法：
85.采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度(analytical biochemistry 1976 72(1-2):248-54)。
86.降解产物及其含量的检测方法：
87.标准品处理：分别称取tpa、mhet、bhet的标准品溶于二甲亚砜(dmso)中制成母液，利用无菌水将母液稀释成0.1 mg/ml标准品溶液，用0.22μm的滤头过滤，用注射器注入液相瓶进行hplc检测；
88.样品处理：将培养液静置10 min，取上清5 ml，12000 rpm离心8 min，用0.22μm的滤头过滤，用注射器注入液相瓶，进行hplc检测。
89.降解率的检测方法：
90.降解率(％)＝((m1/x1+m2/x2+m3/x3)
×
m)/(处理前pet质量)
×
100；
91.m1、m2和m3代表反应混合物体积中tpa、mhet和bhet的重量；m是pet单元的相对分子质量；x1为tpa的相对分子质量；x2为mhet的相对分子质量；x3是bhet的相对分子质量。
92.酶活的检测方法：
93.tris-hcl缓冲液(10 mm ph 7.0)：准确称取tris 1.210 g、nacl 0.584 g、加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解，用hcl调节ph至8.0，定容至1000 ml。
94.底物(50 mmol/l的对硝基苯丁酸酯溶液)：准确称取0.1046 g对硝基苯丁酸酯，用乙腈定容至10 ml，-20℃保存。
95.对硝基苯酚标准曲线的制作：称取13.9 mg对硝基苯酚，用10 mm ph 7.0 tris-hcl缓冲液定容至1000ml，配制成100μmol/l的对硝基苯酚母液，再用10 mm ph 7.0的tris-hcl缓冲液稀释至0、20、40、60、80、100μmol/l。用0.5 cm玻璃比色皿在分光光度计上测定波长为405 nm时的吸光值，以对硝基苯酚浓度c为横坐标，吸光值a为纵坐标，绘制标准曲线a＝a
×
c+b。
96.用5 ml的移液管准确移取1.5 ml tris-hcl缓冲液(37℃提前温育10min)至0.5cm玻璃比色皿中，在吸收波长405nm处调零。取1.44 ml tris-hcl缓冲液至0.5 cm石英比色皿中，取30μl待测稀释酶液加入上述石英比色皿中，取30μl底物溶液，加入上述石英比色皿中，摇匀后立即放入可见分光光度计中，在吸收波长405 nm处测a值。每隔5秒钟记录一次a值，反应时间为1分钟。
[0097][0098]
式中：k：酶反应所测不同时间a值和时间(min)所成曲线的斜率；
[0099]v1
：反应体积(ml)；
[0100]v2
：加酶量(ml)；
[0101]
n：稀释倍数。
[0102]
酶活定义为在65℃、ph8.0的环境下，每min催化对硝基苯丁酸酯水解生成1μmol所对硝基苯酚的酶量为一个酶活单位(u)。
[0103]
变体的制备
[0104]
可以使用本领域已知的任何诱变程序(例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等)来制备本发明的角质酶变体。
[0105]
定点诱变是在编码所述亲本角质酶的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
[0106]
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的pcr可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本角质酶的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。
[0107]
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。
[0108]
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
[0109]
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行。
[0110]
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试。
[0111]
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的dna分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
[0112]
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合pcr技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错pcr或非易错pcr扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
[0113]
多核苷酸
[0114]
本发明还涉及编码本发明的角质酶变体的分离的多核苷酸。在某些方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体。在某些方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的表达载体。在某些方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些方面，本发明涉及产生角质酶变体的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述角质酶变体的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述角质酶变体。
[0115]
核酸构建体
[0116]
本发明还涉及包含编码本发明的角质酶变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸的核酸构建体，所述一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
[0117]
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供角质酶变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
[0118]
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达所述多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导角质酶变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录
活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。
[0119]
表达载体
[0120]
本发明还涉及包含编码本发明的角质酶变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码角质酶变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达所述多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0121]
重组表达载体可以是可以方便地经受重组dna程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
[0122]
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样一种载体，当被引入宿主细胞中时，它被整合到基因组中并与其整合的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总dna，或可以使用转座子。
[0123]
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
[0124]
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1和ura3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)、pyrg(乳清苷-5
’‑
磷酸脱羧酶)、sc(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpc(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)bar基因。
[0125]
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
[0126]
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码角质酶变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，所述载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
[0127]
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0128]
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pbr322、puc19、pacyc177、和pacyc184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pub110、pe194、pta1060、和pamβ1的复制起点。
[0129]
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ars1、ars4、ars1与cen3的组合、及ars4与cen6的组合。
[0130]
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加角质酶变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与所述多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得所述多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此所述多核苷酸的另外的拷贝。
[0131]
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的。
[0132]
宿主细胞
[0133]
本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码本发明的角质酶变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，所述一个或多个控制序列指导本发明的角质酶变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得所述构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码角质酶变体的基因及其来源。
[0134]
宿主细胞可以是在角质酶变体的重组生产中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
[0135]
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
[0136]
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
[0137]
产生方法
[0138]
本发明还涉及产生本发明的角质酶变体的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述角质酶变体的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述角质酶变体。
[0139]
使用本领域已知的方法在适合于产生角质酶变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许角质酶或变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成
制备。如果角质酶变体被分泌到营养介质中，则所述角质酶变体可以直接从培养基中回收。如果角质酶变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
[0140]
可以使用本领域已知的对角质酶变体特异的方法检测角质酶变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定角质酶变体的活性(如实例中所述的那些)。
[0141]
可以使用本领域已知的方法回收角质酶变体。例如，可以通过常规程序从营养介质中回收角质酶变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
[0142]
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化角质酶变体以获得基本上纯的角质酶变体，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page或萃取。
[0143]
在可替代的方面，没有回收角质酶变体，而是将表达角质酶变体的本发明的宿主细胞用作所述角质酶变体的来源。
[0144]
发酵液配制品或细胞组合物
[0145]
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。所述发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
[0146]
如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。所述发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，所述发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
[0147]
组合物
[0148]
本发明还涉及包括本发明的变体角质酶的组合物。
[0149]
这些组合物可以包含本发明的变体角质酶作为主要酶组分，例如，单组分组合物。可替代地，组合物可以包含多种酶活性，例如选自由以下组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：蛋白酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶。
[0150]
角质酶突变体的用途
[0151]
本发明涉及的角质酶突变体可以用来降解和回收利用聚酯，如聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)，可使其酯键断裂，从而实现由对苯二甲酸乙二醇酯聚合而成的物质的降解，使其由不溶状态变为可溶状态。
[0152]
特别地，可以使用本发明的角质酶突变体处理由对苯二甲酸乙二醇酯聚合而成的薄膜。
[0153]
所述角质酶突变体可以用来处理含pet的纺织品，处理后的聚酯纺织物可以增加
穿着舒适度，增加水的穿透性、减小静电、提升手感和柔软度。
[0154]
所述角质酶突变体可以用来改进对含pet的纱线或织物的功能性涂饰，使用本发明所述的角质酶突变体处理纱线或织物，可以增加织物等表面的功能性基团的数目，从而用来吸附功能性涂饰剂。
[0155]
所述角质酶突变体也可以用于脂肪酶和角质酶其他已知的用途中，如造纸业(公开号为cn106480771a的专利文献)、皮革、羊毛及相关产业(公开号为cn104673772a的专利文献)，以及用于其他有关脱脂/去脂的用途。可在脂类和油类制造业中用固定化的所述角质酶突变体作为有机合成的催化剂(如酯化作用、转酯化作用或脂类水解反应)。
[0156]
实施例1：tfc突变体重组质粒的构建
[0157]
(1)将野生型角质酶(氨基酸序列如seq id no:1所示，核苷酸序列如seq id no:11所示)，通过限制性内切酶插入至pet24a的ndeⅰ位点和xhoⅰ位点，得到pet24a-tfc；再利用定点突变技术(site-directed mutagenesis)，以pet24a-tfc质粒为模板，用表1所示的引物分别进行pcr，获得目的基因突变片段(引物如表1所示)。利用megawhop pcr把目的片段与pet-24a表达载体进行连接，获得重组质粒。将构建的重组质粒转化大肠杆菌(escherichia coli)jm109，得到转化产物；将转化产物涂布在lb固体培养基(含有40μg/ml卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至lb液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行测序验证，获得表达不同tfc突变体的重组质粒。
[0158]
表1.引物序列
[0159][0160]
(2)tfc突变体重组大肠杆菌的构建
[0161]
将步骤(1)获得的正确的重组质粒转化大肠杆菌(escherichia coli)bl21，得到转化产物；将转化产物涂布在lb固体培养基(含有50μg/ml卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至lb液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组大肠杆菌：e.coli bl21/pet-24(+)-m1、e.coli bl21/pet-24a(+)-m1、e.coli bl21/pet-24(+)-m2、e.coli bl21/pet-24(+)-m3、e.coli bl21/pet-24(+)-m4、e.coli bl21/pet-24(+)-m5、e.coli bl21/pet-24(+)-m6、e.coli bl21/pet-24(+)-m7、e.coli bl21/pet-24(+)-m8、e.coli bl21/pet-24(+)-m9；
[0162]
(3)tfc突变体的制备
[0163]
将步骤2中获得的tfc突变体重组大肠杆菌以5％(v/v)的接种量转接至100ml的lb液体培养基中，于37℃、200rpm摇床培养3h至od
600
＝0.8后添加iptg至终浓度为0.4mm，于25℃、200rpm继续摇床培养20h，获得发酵液；于8000rpm的条件下离心15min获得上清液，即为
粗酶液。为了快速得到高纯度的酶蛋白，对上述粗酶液进行60℃热处理1h，目的是去除其他杂蛋白。于8000rpm的条件下离心15min获得上清液，即为纯酶液。
[0164]
实施例2：tfc突变体的性能
[0165]
取野生型和tfc突变体测定酶活、蛋白浓度以及耐热性能。
[0166]
如表2所示，与野生型tfc相比，9种tfc的突变体的活性有了明显的提高，如突变体m5由86.5u/ml提高到了150.4u/ml，提升了73.87％。与此同时，突变体的表达量也有了不同程度的提升，如突变体m2由野生型的0.10mg/ml提高到了0.59mg/ml，较野生型提高了4.9倍。
[0167]
相比于野生型tfc而言，9种tfc的突变体在60℃下的热稳定性有了明显的提高，较野生型的96h提升至102～150h，突变体m6的半衰期由96h提高到了150h。
[0168]
表2 tfc突变体的酶活及浓度
[0169]
突变体酶活(u/ml)蛋白浓度(mg/ml)60℃下半衰期(h)野生型86.50.1096m1110.60.41102m2104.30.59110m3111.50.12109m4108.20.29115m5150.40.16136m6124.50.23150m7110.10.21146m899.20.13130m989.50.18139
[0170]
实施例3：tfc突变体对pet的降解性能
[0171]
取ph 8.0，0.1m磷酸缓冲液20ml，向缓冲液中添加100mg聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，以50mg酶蛋白/g底物(即野生型、m1～m9的添加量分别为43250u/g底物，13487u/g底物，8839u/g底物，46458u/g底物，18655u/g底物，47000u/g底物，27065u/g底物，26214u/g底物，38153u/g底物，24861u/g底物，)的添加量分别添加实施例2获得的tfc突变体；60℃、200rpm恒温水浴摇床中反应96h后，反应液煮沸15min灭酶，12,000rpm/min离心10min获得上清液进行hplc分析计算降解率。
[0172]
结果如表3所示，9种tfc的突变体对pet降解效率明显高于野生型tfc蛋白，其中tfc的突变体m8对pet降解率高达90.8％，比野生型提高了近90倍。
[0173]
表3 tfc突变体对pet降解效果
[0174][0175][0176]
实施例4：tfc突变体在处理pet塑料瓶中的应用
[0177]
将塑料瓶剪成2cm
×
2cm大小片，在ph 8.0的缓冲体系中，加入塑料瓶碎片，向其中分别加入实施例1制备得到的tfc突变体(分别为m1～m9)，在60℃下处理120h后，塑料片出现破裂，150h后，塑料片变成碎片化。
[0178]
实施例5：含有tfc突变体的组合物或酶制剂
[0179]
按照实施例1的方法制备角质酶酶蛋白，将酶蛋白与酶保护剂混合；所述保护剂包括酸碱调节剂、冻干保护剂。
[0180]
所述酸碱调节剂为常规的可以维持ph的缓冲液，例如苹果酸-苹果酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、tris-盐酸缓冲液。所述缓冲液用以维持角质酶酶蛋白在其最适ph条件从而保证其最大催化活性。
[0181]
所述冻干保护剂用于降低冻干和/或后续储存过程中角质酶酶蛋白的化学和/或物理不稳定性，包括但不限于糖及其相应的糖醇，诸如蔗糖、乳糖、海藻糖、葡聚糖、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇、甘露醇；氨基酸，诸如精氨酸或组氨酸；易溶盐，诸如硫酸镁；多元醇，诸如丙二醇、甘油、聚(乙二醇)或聚(丙二醇)；及上述任一种的组合。
[0182]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。