一种水稻茉莉酸相关miRNAs的高通量精准筛选方法与流程

一种水稻茉莉酸相关mirnas的高通量精准筛选方法
技术领域
1.本发明涉及一种水稻茉莉酸相关mirnas的高通量精准筛选方法，属于茉莉酸相关的mirna的筛选技术领域。


背景技术：

2.microrna(mirna)是近年来发现的真核生物体内普遍存在的一类具有重要调控功能的非编码小分子rna(srna)，其大小在20-25nt之间。大量研究发现mirna与物种进化过程中重要性状的形成息息相关，在植物的生长、发育和逆境胁迫应答等各种生物学过程中发挥重要的调节作用。
3.茉莉酸及其衍生物是一种广泛分布于植物幼嫩组织和生殖发育器官中的植物激素。茉莉酸信号途径调控着植物的生长发育过程和逆境应答反应。近年来，已有数个参与茉莉素信号途径的mirna在植物中先后被鉴定。研究表明，拟南芥mir319与主效靶基因tcp4可以控制ja的生物合成，从而调控茉莉酸通路及叶片的生长发育和衰老。近期研究发现，ago1蛋白除了具有与mirna结合，通过切割靶mrna从而在转录后水平抑制靶基因表达的功能外，还可以参与植物对茉莉酸和逆境胁迫的响应，直接影响茉莉酸通路基因的激活和信号转导。2020年yang等研究发现茉莉酸信号转录激活argonaute 18(ago18)，这是一个核心rna沉默元件，通过隔离mir168和mir528来促进水稻抗病毒防御。以上研究结果表明，mirna与茉莉酸参与的植物胁迫应答反应密切相关。
4.以往茉莉酸相关mirna的鉴定大多采用激素处理和小rna测序的方法来筛选差异表达的mirna，然而这种茉莉酸相关mirna的筛选方法难以全面准确鉴定茉莉酸相关的mirna。


技术实现要素：

5.基于上述，本发明提供一种水稻茉莉酸相关mirnas的高通量精准筛选方法，以解决现有筛选方法难以快速、全面、准确鉴定茉莉酸相关的mirna的技术问题。
6.本发明的技术方案是：一种水稻茉莉酸相关mirnas的高通量精准筛选方法，包括以下步骤：
7.1)从水稻基因组水平筛选启动子中含茉莉酸调控元件的mirnas；
8.2)根据高通量测序数据筛选茉莉酸甲酯处理后表达量改变的mirnas；
9.3)比较筛选出含茉莉酸调控元件且响应茉莉酸甲酯处理的mirnas；
10.4)对步骤3)中筛选出的mirnas进行定量pcr，筛选出茉莉酸处理后表达量发生改变的mirnas，作为水稻茉莉酸相关mirnas。
11.可选的，所述步骤1)的具体方法为：
12.以水稻亚洲栽培稻oryza sativa粳稻品种日本晴nipponbare为材料，从水稻基因组注释计划数据库中下载release 7.0数据集；从mirbase数据库下载release 21.0中水稻oryza sativa)的所有前体和成熟序列；重新注释mirna，使用fastxtool去除适配序列，将
重复的reads合并为单个条目，并去除19-24nt范围外的reads，用mirdeep-p对每个的mirnas进行de nove鉴定，找出mirna；
13.从基因组中提取基因序列，以mirna的前体序列与这些基因序列进行比对，找出来自于基因的mirna，筛选来自于基因间区的mirna，对于基因间的mirna，提取mirna前体起始位点上游2000bp的序列，如果mirna前体上游的基因间序列小于2000bp，则只取基因间序列；通过tssp程序预测mirna前体序列上游的转录起始位点及tata-box，运用plantpan2.0数据库和plantcare数据库对mirna启动子进行结构分析，预测可能存在的顺式作用元件，寻找茉莉酸调控元件tgacg-motif和cgtca-motif的mirnas，将含有茉莉酸调控元件数量大于4个以上的mirnas作为茉莉酸相关mirnas。
14.可选的，所述步骤2)的具体方法为：
15.从ricexpro数据库下载水稻日本晴茎和根两个组织在茉莉酸甲酯处理不同时长的rna测序数据，找出表达量改变的mirnas，即响应茉莉酸甲酯处理的mirnas。
16.可选的，所述步骤3)的具体方法为：比较步骤1)中含茉莉酸调控元件的mirnas和步骤2)中经茉莉酸甲酯处理后表达量改变的mirnas，找出含茉莉酸调控元件且响应茉莉酸甲酯处理的mirnas。
17.可选的，所述步骤5)的具体方法为：
18.以步骤3)筛选出的茉莉酸相关mirnas为对象，以萌发30d的水稻根和幼苗为材料，分别用100um浓度的茉莉酸甲酯处理2个组织，对照用ddh2o以同样的方式进行处理，处理24h后取植物组织，用trizol法提取所需组织total rna，用dnase i去除残余的dna，用mirna rt primer设计含有待测mirna3
′
端的6个互补碱基并且能形成颈环结构的特异引物，利用试剂盒进行反转录，将反转录所得的cdna稀释后，用sybr green pcr反应体系于荧光定量pcr仪中进行扩增，根据定量pcr的结果筛选出表达量与对照存在明显异常的mirnas。
19.本发明的有益效果是：本发明首先从基因组水平广泛鉴定启动子中含茉莉酸调控元件的mirnas，然后根据高通量测序数据筛选茉莉酸甲酯(meja)处理后表达量改变的mirnas，最后综合序列水平和基因表达水平鉴定的茉莉酸相关mirnas，利用荧光定量pcr确定mirnas对茉莉酸的应答。本发明结合基因组序列和基因表达两种策略实现了高通量精准鉴定水稻茉莉酸相关mirnas的目的，对植物激素相关mirna的研究具有重要意义。
附图说明
20.图1.jap基因组茉莉酸相关mirna家族统计；
21.图2.jap茉莉酸处理后茎组织差异表达的mirnas；
22.图3.jap茉莉酸处理后根组织差异表达的mirnas；
23.图4.jap茉莉酸处理根和茎组织差异表达的mirna家族；
24.图5.jap含茉莉酸调控元件且响应meja的mirna家族；
25.图6.jap茉莉酸相关mirnas定量pcr。
具体实施方式
26.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明
的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
27.一、mirna注释
28.以水稻亚洲栽培稻oryza sativa粳稻品种日本晴nipponbare(jap)为材料，从水稻基因组注释计划数据库(rice genome annotation project database,http://rice.plantbiology.msu.edu)中下载release 7.0数据集。从mirbase数据库(http://www.mirbase.org)下载release 21.0中水稻(oryza sativa)的所有前体和成熟序列。重新注释mirna，具体方法为：使用fastxtool(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)去除适配序列，将重复的reads合并为单个条目，并去除19-24nt范围外的reads。用mirdeep-p对每个的mirnas进行de nove鉴定。在亚洲栽培稻jap中共鉴定到96个mirna家族，共包含310个mirnas，其中新鉴定的mirna家族有32个，包含45个mirnas。
29.表1.jap新注释的mirna及mirna家族
[0030][0031]
二、含茉莉酸调控元件mirnas的筛选
[0032]
首先从基因组中提取基因序列，以mirna的前体序列与这些基因序列进行比对，找出来自于基因的mirna，进一步筛选来自于基因间区的mirna。对于基因间的mirna，提取mirna前体起始位点上游2000bp的序列，如果mirna前体上游的基因间序列小于2000bp，则只取基因间序列，避免取到上游基因的3
′‑
utr区域。通过tssp程序(http://linux1.softberry.com/berry.phtml？group＝programs&subgroup＝promoter&topic＝tssp)预测mirna前体序列上游的转录起始位点(tss)及tata-box，运用plantpan2.0(http://plantpan2.itps.ncku.edu.tw/)数据库和plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)数据库对mirna启动子进行结构分析，预测可能存在的顺式作用元件。寻找meja(茉莉酸)调控元件tgacg-motif(tgacc)和cgtca-motif(cgtca)的mirnas，将含有茉莉酸调控元件数量大于4个以上的mirnas作为茉莉酸相关mirnas。
[0033]
从jap中共获得95个含有茉莉酸调控元件的mirnas，如表2所示，其中有42个mirnas的茉莉酸调控元件大于10。这些mirnas主要分布在osa-mir1428、osa-mir159、osa-mir164、osa-mir169、osa-mir172、osa-mir395及新鉴定的osa-novel-r等36个mirna家族。
[0034]
表2.jap基因组茉莉酸相关mirnas
[0035]
mir159、osa-mir164、osa-mir166、osa-mir167、osa-mir171、osa-mir395、osa-mir399等46个mirna家族(图4)。
[0039]
四、茉莉酸相关mirnas复筛
[0040]
为确定茉莉酸相关的mirnas，结合mirna的启动子meja调控元件分析和meja处理后表达量改变两种结果进行复筛。
[0041]
综合比较水稻启动子含茉莉酸调控元件的95个mirnas及根和茎中meja处理后表达量发生变化的170个mirnas，发现水稻中共有51个mirnas含茉莉酸调控元件且响应meja，这些mirnas分布在15个mirna家族，其中家族成员最多的为osa-mir395，其次为mir169和mir399(表3和图5)。
[0042]
表3.jap含茉莉酸调控元件且响应meja的mirnas
[0043][0044]
五、莉酸相关mirnas的荧光定量pcr确定
[0045]
以上述鉴定的茉莉酸相关mirnas为对象，以萌发30d的水稻根和幼苗为材料，分别用100um的茉莉酸处理2个组织，每个处理进行3次重复，对照用ddh2o以同样的方式进行处理，处理24h后取植物组织，用trizol法提取所需组织total rna，用dnase i去除残余的dna。用mirna rt primer设计含有待测mirna 3
′
端的6个互补碱基并且能形成颈环结构的特异引物，利用primer5.0设计定量pcr引物(见表4)，利用one-step rt-pcr supermix试剂盒进行反转录，将反转录所得的cdna稀释5倍后，用sybr green pcr反应体系于荧光定量pcr仪中进行扩增。根据定量pcr的结果筛选出表达量与对照存在明显异常的mirnas。扩增体系为：95℃，5min；(95℃，20s；58℃，20s)，共40个循环；72℃，40s，以u6作内参，茉莉酸处理前的根和茎的表达量分别设为“1”，用2
(
–
δδct)
公式进行计算表达量。
[0046]
表4定量pcr引物
[0047]
[0048][0049]
表4中由上至下的引物序列如seq id no.1至61所示。
[0050]
由定量pcr结果可以看出(图6)，meja处理24h后，共有18条成熟的mirnas序列表达量发生明显改变，由于部分mirna家族的成员成熟序列一致而具有相同的表达量，因此，该18条成熟mirnas序列共涵盖31个mirnas，包括osa-mir156、osa-mir159、osa-mir160、osa-mir164、osa-mir166、osa-mir167、osa-mir 390、osa-mir395等8个mirna家族。这个结果一方面确定了水稻根和茎中响应茉莉酸的31个mirnas，同时也证明启动子元件分析和meja处理后小rna测序相结合鉴定的mirnas大多数参与茉莉酸应答。以往的方法主要通过高通量
测序来获得激素调控相关的mirnas，然而高通量测序鉴定的差异mirnas数量较多，水稻中茉莉酸相关mirnas多达170个以上，往往高通量测序获得的差异mirnas存在较多假阳性，需要用定量pcr进行验证，这大大增加了工作量和研究成本。而本发明从启动子元件出发鉴定含有茉莉酸调控元件mirnas的方法，可以从基因组水平快速筛选参与茉莉酸调控的mirnas，结合高通量测序可以有效缩小筛选范围，本发明结合高通量测序和调控元件分析，最终从170个茉莉酸调控的mirnas中筛选出51个mirnas，最终根据实时荧光定量pcr鉴定出31个mirnas在响应茉莉酸。该方法可以高效精确地筛选茉莉酸相关mirnas，为茉莉酸相关mirnas的高通量筛选提供保障，在植物激素相关mirna研究中具有重要意义。