一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法

1.本发明属于生物催化剂领域，具体涉及一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法。


背景技术：

2.苄基异喹啉生物碱(bias)是植物特有的代谢物，由约2500个化合物组成一个大家族。这些化合物因具备多种生物活性，如抗菌、抗炎、抗病毒和抗疟原虫活性而受到越来越多的关注。典型的bias，如诺司卡平、吗啡和罂粟碱分别被用作咳嗽抑制剂、麻醉止痛剂和肌肉松弛剂。此外，一些bias被确定为针对新病毒sars-cov-2的进入抑制剂，而sars-cov-2是导致2019年冠状病毒病(covid-19)的主要因素。因此，生物碱的有效合成具有重要的意义。
3.工业上，bias的合成还主要依赖于从植物组织中提取或者化学合成的方法。然而，传统的提取方法存在一些局限性，包括效率低、成本高、耗时长，而化学合成也面临挑战，例如结构复杂性和不利于环境的试剂的使用。另外，合成生物学的快速发展为合成bias提供了新的思路。最常用的方法是通过在微生物(如酿酒酵母或大肠杆菌)中构建异源途径，将单糖作为起始材料的从头合成。该方法旨在模拟植物中的自然生物合成途径，但这些途径往往涉及多步反应、多个酶，从而造成较低的合成效率。此外，体外酶级联的方法也是近年来较为常用的手段。该方法通常以l-酪氨酸衍生物为底物，在产物产量和立体选择性方面表现出了巨大的潜力。但该方法涉及多个酶的纯化与制备，往往需要较高的成本。化学酶级联为合成复杂的bias提供了另一种方法，尤其是具有高立体选择性的bias，但该方法通常面临着化学和酶转化所需条件的不相容性的挑战。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法。本发明通过构建生物催化级联催化对香豆酸衍生物和多巴胺合成苄基异喹啉生物碱。
5.本发明通过基因工程手段改造大肠杆菌，构建了两条新的生物催化级联，利用多巴胺、木质纤维素衍生的对香豆酸及其类似物高效合成包含(s)-去甲乌药碱及(s)-全去甲劳丹碱在内的多种苄基异喹啉生物碱，产物具备很好的对映选择性(≥98％ee)，多数的浓度大于1g
·
l-1
。
6.本发明的目的可以通过以下方案来实现：
7.本发明提供了一种通过构建生物级联反应合成苄基异喹啉生物碱的方法，所述方法包括如下步骤：
8.s1、对大肠杆菌进行改造，构建脱羧-环氧-异构-缩合的生物催化级联，获得生物催化剂；
9.s2、以多巴胺与对香豆酸或其衍生物为催化底物，通过生物催化剂合成苄基异喹
啉生物碱。
10.作为本发明的一个实施方案，所述对香豆酸衍生物包括阿魏酸、咖啡酸、肉桂酸、3-羟基肉桂酸、3-甲基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸中的一种。
11.作为本发明的一个实施方案，所述苄基异喹啉生物碱包括(s)-去甲乌药碱、(s)-全去甲劳丹碱、(s)-1、(s)-2、(s)-3、(s)-4、(s)-5、(s)-6、(s)-7；
[0012][0013]
(s)-7结构式如下：
[0014][0015]
作为本发明的一个实施方案，所述生物催化级联脱羧-环氧-异构-缩合的构建是通过在e.coli中过表达来源于bacillus licheniformis cgmcc7172的脱羧酶blpad、来源于pseudomonas sp.strain vlb120的苯乙烯单加氧酶styab、来源于rhodococcus opacus 1cp的环氧化物异构酶rostyc、来源于thalictrum flavum的去甲乌药碱合成酶突变体δ29tfncs、来源于aspergillus niger的脱羧酶anpad(编码基因为fdc和pad)中的一种或多种实现。本发明使用的酶是已知的酶，可以通过文献报道或者ncbi中获得。本发明通过在大肠杆菌内过表达脱羧酶、苯乙烯单加氧酶、环氧化物异构酶以及去甲乌药碱合成酶中一种或多种，构建脱羧-环氧-异构-缩合的催化级联，制得生物催化剂。
[0016]
此过程中，构建四个生物催化剂zmts 1-4催化多巴胺和对香豆酸合成(s)-去甲乌药碱，选出最优的生物催化剂进一步催化多巴胺和咖啡酸合成(s)-全去甲劳丹碱，催化多巴胺和阿魏酸合成一种非天然苄基异喹啉生物碱；构建生物催化剂zmts 5催化多巴胺和对香豆酸衍生物(肉桂酸、3-羟基肉桂酸、3-甲基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸以及3,4-二甲氧基肉桂酸)成功地合成了6种非天然的苄基异喹啉生物碱。
[0017]
作为本发明的一个实施方案，所述催化剂是将质粒pet28a-styab-rostyc-7-blpad、pa7a-δ29tfncs、pb7c-δ29tfncs、pet28a-styab-rostyc、pa7a-blpad-7-δ29tfncs、pb7c-blpad-7-δ29tfncs、pet28a-styab-rostyc-7-anpad和pa7a-δ29tfncs中的两个结合导入大肠杆菌构建所得。质粒pet28a-styab-rostyc-7-blpad中7表示t7启动
子，在blpad基因前添加t7启动子。质粒pb7c-blpad-7-δ29tfncs中7表示t7启动子，在δ29tfncs基因前添加t7启动子。质粒pet28a-styab-rostyc-7-anpad中7表示t7启动子，在fdc和pad基因前添加t7启动子。本发明使用的质粒是已知的质粒，可以从已报道的文献中获取。
[0018]
作为本发明的一个实施方案，所述质粒pet28a-styab-rostyc-7-blpad是将blpad、styab和rostyc通过酶切连接进入载体pet28a构建所得。
[0019]
作为本发明的一个实施方案，所述质粒pet28a-styab-rostyc是将styab和rostyc通过酶切连接进入载体pet28a构建所得。
[0020]
作为本发明的一个实施方案，所述质粒pa7a-δ29tfncs是将δ29tfncs通过酶切连接进入载体pa7a构建所得。
[0021]
作为本发明的一个实施方案，所述质粒pb7c-δ29tfncs是将δ29tfncs通过酶切连接进入载体pb7c构建所得。
[0022]
作为本发明的一个实施方案，所述质粒pa7a-blpad-7-δ29tfncs是将blpad和δ29tfncs通过酶切连接进入载体pa7a构建所得。
[0023]
作为本发明的一个实施方案，所述质粒pb7c-blpad-7-δ29tfncs是将blpad和δ29tfncs通过酶切连接进入载体pb7c构建所得。
[0024]
作为本发明的一个实施方案，所述质粒pet28a-styab-rostyc-7-anpad是将anpad、styab和rostyc通过酶切连接进入载体pet28a构建所得。
[0025]
作为本发明的一个实施方案，所述质粒pa7a-δ29tfncs是将δ29tfncs通过酶切连接进入载体pa7a构建所得。
[0026]
作为本发明的一个实施方案，所述生物催化剂包括生物催化剂zmts 1、生物催化剂zmts 2、生物催化剂zmts 3、生物催化剂zmts 4、生物催化剂zmts 5；所述生物催化剂zmts 1由质粒pet28a-styab-rostyc-7-blpad和pa7a-δ29tfncs通过热激转化进入大肠杆菌制得；zmts 2由质粒pet28a-styab-rostyc-7-blpad和pb7c-δ29tfncs通过热激转化进入大肠杆菌制得；zmts 3由质粒pet28a-styab-rostyc和pa7a-blpad-7-δ29tfncs通过热激转化进入大肠杆菌制得；zmts 4由质粒pet28a-styab-rostyc和pb7c-blpad-7-δ29tfncs通过热激转化进入大肠杆菌制得；zmts 5由质粒pet28a-styab-rostyc-7-anpad和pa7a-δ29tfncs结合导入大肠杆菌构建所得。
[0027]
作为本发明的一个实施方案，催化剂zmts 1-4的催化底物为对香豆酸时，产物为(s)-去甲乌药碱；催化剂zmts 1-4的催化底物为阿魏酸时，产物为(s)-1；催化剂zmts 1-4的催化底物为咖啡酸时，产物为(s)-全去甲劳丹碱。
[0028]
作为本发明的一个实施方案，催化剂zmts 5的催化底物为肉桂酸时，产物为(s)-2；催化剂zmts 5的催化底物为3-羟基肉桂酸时，产物为(s)-3；催化剂zmts 5的催化底物为3-甲基肉桂酸时，产物为(s)-4；催化剂zmts 5的催化底物为3-甲氧基肉桂酸时，产物为(s)-5；催化剂zmts 5的催化底物为4-甲氧基肉桂酸时，产物为(s)-6；催化剂zmts 5的催化底物为3,4-二甲氧基肉桂酸时，产物为(s)-7。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0030]
(1)通过基因工程手段，构建新的生物催化级联，获得高效的生物催化剂，可以快速催化底物多巴胺和对香豆酸衍生物合成包含(s)-去甲乌药碱在内的多种苄基异喹啉生
物碱。
[0031]
(2)利用构建的生物催化剂，在多巴胺参与下，通过生物转化实现了木质纤维素来源的芳香化合物(对香豆酸及其衍生物)的高效利用，相比较于以葡萄糖为底物的从头合成、体外酶级联以及化学酶促级联，更具优势。
[0032]
(3)通过本发明，获得的目的化合物产量大都在克及以上，并且都具备很好的对映选择性(≥98％ee)，具有极大的应用潜力。
附图说明
[0033]
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0034]
图1构建生物催化级联催化对香豆酸衍生物和多巴胺合成苄基异喹啉生物碱反应示意图；
[0035]
图2构建生物催化剂用于催化对香豆酸衍生物和多巴胺合成bias构建示意图；
[0036]
图3不同的生物催化剂催化对香豆酸和多巴胺合成(s)-去甲乌药碱浓度示意图。
具体实施方式
[0037]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。
[0038]
实施例1
[0039]
(1)构建生物催化级联用于催化香豆酸衍生物(对香豆酸、阿魏酸和咖啡酸)和多巴胺(构建示意图如图1所示)
[0040]
构建质粒pet28a-styab-rostyc-7-blpad(7表示t7启动子，在blpad基因前添加t7启动子)、pa7a-δ29tfncs、pb7c-δ29tfncs、pet28a-styab-rostyc、pa7a-blpad-7-δ29tfncs和pb7c-blpad-7-δ29tfncs(7表示t7启动子，在δ29tfncs基因前添加t7启动子)，将其两两结合导入大肠杆菌构建4种生物催化剂zmts 1、zmts 2、zmts 3以及zmts 4(构建示意图如图2所示)。具体方法如下：
[0041]
将blpad、styab和rostyc通过酶切连接进入载体pet28a构建质粒pet28a-styab-rostyc-7-blpad和pet28a-styab-rostyc；将δ29tfncs通过酶切连接进入载体pa7a和pb7c分别构建质粒pa7a-δ29tfncs和pb7c-δ29tfncs；将blpad和δ29tfncs通过酶切连接进入载体pa7a构建质粒pa7a-blpad-7-δ29tfncs；将blpad和δ29tfncs通过酶切连接进入载体pb7c构建质粒pb7c-blpad-7-δ29tfncs。
[0042]
上述生物催化剂zmts 1由质粒pet28a-styab-rostyc-7-blpad和pa7a-δ29tfncs通过热激转化进入大肠杆菌制得；zmts 2由质粒pet28a-styab-rostyc-7-blpad和pb7c-δ29tfncs通过热激转化进入大肠杆菌制得；zmts 3由质粒pet28a-styab-rostyc和pa7a-blpad-7-δ29tfncs通过热激转化进入大肠杆菌制得；zmts 4由质粒pet28a-styab-rostyc和pb7c-blpad-7-δ29tfncs通过热激转化进入大肠杆菌制得。
[0043]
(2)生物转化(合成产物浓度示意图如图3所示)
[0044]
将制备的生物催化剂zmts 1-4分别接种到2ml lb中活化种子，37℃，10-12h后，按比列1:100转接到100ml lb中，待od
600
达到0.6时，加入诱导剂iptg至终浓度0.5mm，25℃下诱导5h后，4℃，4000g离心10min，收集菌体，重悬浮于hepes缓冲液(50mm,ph 7.0，od
600
＝30)中，添加10mm对香豆酸、10mm多巴胺、10g/l葡萄糖以及10mm抗坏血酸钠，37℃转化1h。结果如图，zmts 1-4分别合成8.7、6.8、8.4以及7.5mm的(s)-去甲乌药碱。重复上述条件，重新制备生物催化剂zmts 1重悬浮于hepes缓冲液(50mm,ph 7.0，od
600
＝30)中，分别添加5mm(阿魏酸或者咖啡酸)、5mm多巴胺、10g/l葡萄糖以及5mm抗坏血酸钠，37℃转化2h。反应结束后可以获得1.8mm(s)-1和2.3mm(s)-全去甲劳丹碱(见表1)。
[0045]
表1
[0046][0047]
表1生物催化剂zmts 1催化底物(阿魏酸和咖啡酸)和多巴胺合成相应的bias。
[0048]
实施例2
[0049]
(1)构建生物催化级联用于催化对香豆酸衍生物(肉桂酸、3-羟基肉桂酸、3-甲基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸以及3,4-二甲氧基肉桂酸)和多巴胺(构建示意图如图1所示)
[0050]
构建质粒pet28a-styab-rostyc-7-anpad(7表示t7启动子，在fdc和pad基因前添加t7启动子)和pa7a-δ29tfncs将其两两结合导入大肠杆菌构建生物催化剂zmts 5(构建示意图如图2所示)。具体方法如下：
[0051]
将anpad、styab和rostyc通过酶切连接进入载体pet28a构建质粒pet28a-styab-rostyc-7-anpad；将δ29tfncs通过酶切连接进入载体pa7a构建质粒pa7a-δ29tfncs。
[0052]
上述生物催化剂zmts 5由质粒pet28a-styab-rostyc-7-anpad和pa7a-δ29tfncs通过热激转化进入大肠杆菌制得。
[0053]
(2)生物转化
[0054]
将制备的生物催化剂zmts 5接种到2ml lb中活化种子，37℃，10-12h后，按比列1:100转接到100ml lb中，待od600达到0.6时，加入诱导剂iptg至终浓度0.5mm，25℃下诱导5h后，4℃，4000g离心10min，收集菌体，重悬浮于hepes缓冲液(50mm,ph 7.0，od
600
＝30)中，添加10mm对香豆酸衍生物底物(肉桂酸、3-羟基肉桂酸、3-甲基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、4-甲
氧基肉桂酸以及3,4-二甲氧基肉桂酸)、10mm多巴胺、10g/l葡萄糖以及10mm抗坏血酸钠，37℃转化2h。反应结果见表2，分别合成9.1、3.3、7.1、8.4、7.7和3.2mm的(s)-2、(s)-3、(s)-4、(s)-5、(s)-6和(s)-7。
[0055]
表2
[0056][0057][0058]
表2生物催化剂催化底物(肉桂酸、3-羟基肉桂酸、3-甲基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸以及3,4-二甲氧基肉桂酸)和多巴胺合成相应的bias。
[0059]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。