纳米抗体的层析方法与流程

1.本发明涉及抗体纯化技术领域，特别是涉及一种纳米抗体的层析方法。


背景技术：

2.抗体（antibody）是一种由机体免疫系统针对外源物质（如细菌、病毒的蛋白）所产生的一种球状蛋白质，因此又被称为免疫球蛋白（ig）。近年来，随着抗体药物不断应用于更多治疗领域，抗体药物的结构也变得更为多样化。其中，纳米抗体（nanobodies，nbs）因具有较小的相对分子质量，相比较传统的单克隆抗体具有独特的优势，包括免疫原性相对较弱、组织渗透性增强等，其独特的分子结构也使其适用于疾病诊断治疗等诸多领域。
3.抗体在应用时通常均需要经过层析纯化。针对传统的单克隆抗体的层析方法可如：有方法应用疏水相互作用层析联用层析纯化抗体分子蛋白，该过程可顺序包括蛋白a亲合层析、离子交换层析和疏水相互作用层析的步骤。该方法能够去除并回收抗体中的无免疫球蛋白聚集、错误折叠种类以及宿主细胞蛋白（hcp）和蛋白a的单体igg抗体。
4.还有方法提供了一种人胰高血糖素样肽-1（hglp-1）类似物融合蛋白（包括度拉鲁肽）的纯化方法，包括采用三步层析法进行纯化：所述样品先经粗纯步骤protein a亲和层析，以有效去除hcp、内毒素等杂质且维持较高的目的蛋白收率；然后再使用阴离子交换层析和疏水层析来进一步精细纯化，以有效去除所述样品中的电荷异构体、残留的hcp和其它痕量杂质，并将各杂质含量控制在用药安全范围以内，且维持较高的目的蛋白收率和活性。
5.但是，目前纳米抗体的分子设计并不是十分成熟，与传统的单克隆抗体相比，纳米抗体存在稳定性差、易聚集的问题，且产生的聚集体以及如hcp、宿主细胞dna（hcd）等杂质更难通过传统的层析方法去除。


技术实现要素：

6.基于此，本发明提供一种能够有效去除聚集体、宿主细胞蛋白（hcp）和宿主细胞dna（hcd）的纳米抗体的层析方法。
7.具体地技术方案如下：本发明提供一种纳米抗体的层析方法，包括如下步骤：s1：对纳米抗体收获液进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；s2：调节所述亲和层析洗脱液的ph为5
±
0.5、纳米抗体浓度≤6mg/ml，然后加入(nh4)2so4调节电导率至80
±
20ms/cm，制备待层析液；s3：对所述待层析液进行疏水层析，所述疏水层析包括如下步骤：s31：将所述待层析液上样至疏水层析柱；s32：第一次淋洗：采用的第一淋洗液的ph为5.5
±
0.5，所述第一淋洗液包含：12
±
2mm的naac、1.7
±
0.5mm的hac以及0.9
±
0.5m的(nh4)2so4，所述第一淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；
s33：第二次淋洗：采用的第二淋洗液的ph为5
±
0.5，所述第二淋洗液包含：10
±
2mm的naac、70
±
5mm的hac、0.05
±
0.01m精氨酸以及0.6
±
0.5m的(nh4)2so4，所述第二淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；s34：洗脱：采用的第一洗脱液的ph为5
±
0.5，所述第一洗脱液包含：10
±
2mm的naac、73
±
5mm的hac、0.05
±
0.01m精氨酸以及10
±
0.5mm的(nh4)2so4，所述第一洗脱液的用量≥10倍柱体积，保留时间≥5分钟；收峰参数为峰前250mau/mm~峰后50mau/mm。
8.在其中一个实施例中，步骤s2中的(nh4)2so4是以浓度为1m~5m的水溶液形式加入。
9.在其中一个实施例中，步骤s31中，上样的载量范围为10~20g/l，上样的温度为18℃~26℃，保留时间≥5分钟。
10.在其中一个实施例中，步骤s31中，所述疏水层析柱采用的填料为键合有苯基官能团的疏水填料，粒径为65μm。
11.在其中一个实施例中，步骤s31中，所述疏水层析柱采用的填料为toyopearl phenyl-650m。
12.在其中一个实施例中，所述纳米抗体的分子大小为75kd~85kd。
13.在其中一个实施例中，步骤s1中，亲和层析的步骤包括：s11：将所述纳米抗体收获液上样至亲和层析柱；s13：采用第三淋洗液进行淋洗，所述第三淋洗液的ph为7
±
0.5，所述第三淋洗液包含：20
±
2mm的tris、20
±
2mm的hac以及0.15
±
0.05m的nacl，所述第三淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；s13：采用第二洗脱液进行洗脱，所述第二洗脱液的ph为3
±
0.5，所述第二洗脱液包含：20
±
2mm的naac以及20
±
2mm的hac，所述第二洗脱液的用量≥5倍柱体积，保留时间≥5分钟；收峰参数为峰前50mau/mm~峰后50mau/mm。
14.在其中一个实施例中，步骤s11中，上样的载量范围为10~50g/l，上样的温度为18℃~26℃，保留时间≥5分钟。
15.在其中一个实施例中，步骤s31中，上样至疏水层析柱之前，还包括柱冲洗、消毒和平衡的步骤。
16.在其中一个实施例中，柱冲洗的步骤包括：采用注射用水进行冲洗，所述注射用水的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟。
17.在其中一个实施例中，消毒的步骤包括：采用0.3m~1m的naoh水溶液进行冲洗，所述naoh水溶液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟。
18.在其中一个实施例中，平衡的步骤包括：采用平衡液冲洗，所述平衡液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟；所述平衡液的ph为5.5
±
0.5，所述平衡液包含：12
±
2mm的naac、1.7
±
0.5mm的hac以及0.9
±
0.5m的(nh4)2so4。
19.上述纳米抗体的层析方法，通过合理设置各工艺步骤，特别是在疏水层析前对样品进行特定的调配，以及采用特定配伍的淋洗液和洗脱液对样品进行疏水层析，能够有效去除样品中的聚集体、宿主细胞蛋白（hcp）和宿主细胞dna（hcd）。同时，还能够在疏水层析过程中维持纳米抗体的稳定性，减少聚集体的形成。
具体实施方式
20.以下结合具体实施例对本发明的纳米抗体的层析方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
21.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
22.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
23.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
24.本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
25.本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
26.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
27.若无特别说明，本发明中涉及的溶液的溶剂均为注射用水。
28.本发明中涉及的缩写的含义如下：hcp：宿主细胞蛋白；hcd：宿主细胞dna；naac：醋酸钠；hac：醋酸；arg：精氨酸；wfi：注射用水；ppm：浓度单位，表示ng/mg；ppb：浓度单位，表示pg/mg；m：浓度单位，表示mol/l；mm：浓度单位，表示mmol/l；se-hplc:凝胶过滤色谱。
29.本发明提供一种纳米抗体的层析方法，包括如下步骤：s1：对纳米抗体收获液进行亲和层析，收集亲和层析洗脱液；s2：调节亲和层析洗脱液的ph为5
±
0.5、纳米抗体浓度≤6mg/ml，然后加入(nh4)2so4调节电导率至80
±
20ms/cm，制备待层析液；s3：对待层析液进行疏水层析，疏水层析包括如下步骤：s31：将所述待层析液上样至疏水层析柱；
s32：第一次淋洗：采用的第一淋洗液的ph为5.5
±
0.5，第一淋洗液包含：12
±
2mm的naac、1.7
±
0.5mm的hac以及0.9
±
0.5m的(nh4)2so4，第一淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；s33：第二次淋洗：采用的第二淋洗液的ph为5
±
0.5，第二淋洗液包含：10
±
2mm的naac、70
±
5mm的hac、0.05
±
0.01m精氨酸以及0.6
±
0.5m的(nh4)2so4，第二淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；s34：洗脱：采用的第一洗脱液的ph为5
±
0.5，所述第一洗脱液包含：10
±
2mm的naac、73
±
5mm的hac、0.05
±
0.01m精氨酸以及10
±
0.5mm的(nh4)2so4，第一洗脱液的用量≥10倍柱体积，保留时间≥5分钟；收峰参数为峰前250mau/mm~峰后50mau/mm。
30.在其中一个具体的示例中，纳米抗体的分子大小为75kd~85kd。具体地，纳米抗体的分子大小包括但不限于：75kd、76kd、77kd、78kd、79kd、80kd、81kd、82kd、83kd、84kd、85kd。
31.具体地，步骤s1为亲和层析步骤。
32.在其中一个具体的示例中，步骤s1中，亲和层析的步骤包括：s11：将纳米抗体收获液上样至亲和层析柱；s13：采用第三淋洗液进行淋洗，第三淋洗液的ph为7
±
0.5，第三淋洗液包含：20
±
2mm的tris、20
±
2mm的hac以及0.15
±
0.05m的nacl，第三淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；进一步地，第三淋洗液的用量为3~5倍柱体积，保留时间为5min~10min；s13：采用第二洗脱液进行洗脱，第二洗脱液的ph为3
±
0.5，第二洗脱液包含：20
±
2mm的naac以及20
±
2mm的hac，第二洗脱液的用量≥5倍柱体积，保留时间≥5分钟；进一步地，第二洗脱液的用量为5~10倍柱体积，保留时间为5min~10min；收峰参数为峰前50mau/mm~峰后50mau/mm。
33.在其中一个具体的示例中，纳米抗体收获液的制备方法包括如下步骤：取细胞培养液进行离心、除菌和过滤，收集上清液。
34.在其中一个具体的示例中，步骤s11中，上样的载量范围为10~50g/l，上样的温度为18℃~26℃，保留时间≥5分钟。进一步地，保留时间为5min~10min。
35.在其中一个具体的示例中，步骤s11中，上样至亲和层析柱之前，还包括柱冲洗、消毒和平衡的步骤。
36.在其中一个具体的示例中，柱冲洗的步骤包括：采用注射用水进行冲洗，注射用水的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟。进一步地，注射用水的用量为3~5倍柱体积，保留时间为3min~5min。
37.在其中一个具体的示例中，消毒的步骤包括：采用0.05m~0.2m的naoh水溶液进行冲洗，naoh水溶液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟。进一步地，naoh水溶液的用量为3~5倍柱体积，保留时间为3min~5min。
38.在其中一个具体的示例中，平衡的步骤包括：采用平衡液冲洗，平衡液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟；进一步地，平衡液的用量为3~5倍柱体积，保留时间为3min~5min；平衡液的ph为7
±
0.5，平衡液包含：20
±
2mm的tris、20
±
2mm的hac以及0.15
±
0.05m的nacl。
39.步骤s2为疏水层析前的调样步骤。
40.在其中一个具体的示例中，步骤s2中，调节亲和层析洗脱液的ph为5
±
0.5的方法为用1.5m~2.5m精氨酸的水溶液将亲和层析洗脱液调节ph至5
±
0.5。
41.在其中一个具体的示例中，步骤s2中，调节亲和层析洗脱液中纳米抗体的浓度≤6mg/ml的方法为加注射用水稀释。
42.在其中一个具体的示例中，步骤s2中，调节电导率至80
±
20ms/cm的(nh4)2so4以浓度为1m~5m的水溶液形式加入。具体地，该(nh4)2so4的浓度包括但不限于：1m、2m、3m、4m、5m。进一步地，调节的过程中需缓慢加入(nh4)2so4并持续低速搅拌，低速搅拌的速率可为60~120转/min。
43.可以理解地，调样后需立即上样进行疏水层析，每一个疏水层析循环需单独调样。
44.具体地，步骤s2中，调节亲和层析洗脱液的ph为5、浓度≤6mg/ml，然后加入(nh4)2so4调节电导率至80ms/cm，制备待层析液。
45.步骤s3为疏水层析步骤。
46.在其中一个具体的示例中，步骤s3中，疏水层析柱中的填料为键合有苯基官能团的疏水填料，粒径范围为65μm。进一步地，疏水层析采用的填料为toyopearl phenyl-650m。
47.在其中一个具体的示例中，上样之前，先对疏水层析柱进行柱冲洗、消毒和平衡。
48.在其中一个具体的示例中，柱冲洗的步骤包括：采用注射用水进行冲洗，注射用水的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟。进一步地，注射用水的用量为3~5倍柱体积，保留时间为3min~5min。
49.在其中一个具体的示例中，消毒的步骤包括：采用0.3m~1m的naoh水溶液进行冲洗，naoh水溶液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟。进一步地，naoh水溶液的用量为3~5倍柱体积，保留时间为3min~5min。具体地，该naoh水溶液的浓度包括但不限于：0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m。
50.在其中一个具体的示例中，平衡的步骤包括：采用平衡液进行冲洗，平衡液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟；进一步地，平衡液的用量为3~5倍柱体积，保留时间为3min~5min；平衡液的ph为5.5
±
0.5，平衡液包含：12
±
2mm的naac、1.7
±
0.5mm的hac以及0.9
±
0.5m的(nh4)2so4。进一步地，平衡液的ph为5.5，平衡液包含：12mm的naac、1.7mm的hac以及0.9m的(nh4)2so4。
51.步骤s31为上样步骤。
52.在其中一个具体的示例中，步骤s31中，上样的载量范围为10~20g/l，上样的温度为18℃~26℃，保留时间≥5分钟。进一步地，保留时间为5min~10min。
53.步骤s32为第一次淋洗步骤。
54.在其中一个具体的示例中，采用的第一淋洗液的ph为5.5，第一淋洗液包含：12mm的naac、1.7mm的hac以及0.9m的(nh4)2so4，第一淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；进一步地，第一淋洗液的用量为3~5倍柱体积，保留时间为5min~10min。
55.步骤s33为第二次淋洗步骤。
56.在其中一个具体的示例中，采用的第二淋洗液的ph为5，第二淋洗液包含：10mm的naac、70mm的hac、0.05m arg以及0.6m的(nh4)2so4，第二淋洗液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥5分钟；进一步地，第二淋洗液的用量为3~5倍柱体积，保留时间为5min~10min。
57.步骤s34为第二次淋洗步骤。
58.在其中一个具体的示例中，采用的第一洗脱液的ph为5，洗脱液包含：10mm的naac、73mm的hac、0.05m arg以及10mm的(nh4)2so4，第一洗脱液的用量≥10倍柱体积，保留时间≥5分钟；进一步地，第一洗脱液的用量为10~30倍柱体积，保留时间为5min~30min；收峰参数为峰前250mau/mm~峰后50mau/mm。
59.另外，在疏水层析结束后，还包括对层析柱进行再生、消毒和保存的步骤。
60.在其中一个具体的示例中，再生的步骤包括：采用注射用水进行冲洗，注射用水的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟；进一步地，注射用水的用量为3~5倍柱体积，保留时间为3min~5min。
61.在其中一个具体的示例中，消毒的步骤包括：采用0.3m~1m的naoh水溶液进行冲洗，naoh水溶液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟；进一步地，naoh水溶液的用量为3~5倍柱体积，保留时间为3min~5min。具体地，该naoh水溶液的浓度包括但不限于：0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m。
62.在其中一个具体的示例中，保存的步骤包括：采用0.05m~0.25m的naoh水溶液进行冲洗，naoh水溶液的用量≥3倍柱体积，保留时间≥3分钟；进一步地，naoh水溶液的用量为3~5倍柱体积，保留时间为3min~5min。具体地，该naoh水溶液的浓度包括但不限于：0.05m、0.1m、0.15m、0.2m、0.25m。
63.以下为具体的实施例。
64.实施例的疏水层析采用的填料为toyopearl phenyl-650m，货号：0014783；厂家：tosoh。
65.实施例的纳米抗体为cho细胞系表达的（中国仓鼠卵巢细胞）igg4类型纳米抗体。
66.实施例1本实施例为一种纳米抗体的层析方法，纳米抗体的分子大小约为77kd。
67.（1）亲和层析步骤如下：1.1柱冲洗：使用注射用水冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；1.2前消毒：使用0.1m naoh冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；1.3平衡：使用平衡液（20mm tris+20mmhac+0.15m nacl，ph 7.0）冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；1.4上样：取细胞培养液离心并除菌、过滤后取上清液，上样载量为30g/l，上样温度为20℃，保留时间8分钟；1.5淋洗：使用平衡液进行淋洗20mm tris+20mm hac+0.15m nacl，ph 7.0）冲洗层析柱至少4倍柱体积，工艺保留时间不少于8分钟；1.6洗脱：使用洗脱液进行洗脱（20mm naac+20mm hac，ph 3.0）冲洗层析柱8倍柱体积，工艺保留时间8分钟；洗脱液收峰参数为峰前50mau/mm~峰后50mau/mm（检测设备型号：akta avant150，供应商cytiva）；得到亲和层析洗脱液；1.7再生：使用0.5 m醋酸溶液冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；1.8消毒：使用0.1m naoh冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；1.9保存：使用2%苯甲醇冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟。
68.（2）疏水层析步骤如下：2.1柱冲洗：使用注射用水冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；
2.2前消毒：使用0.5m naoh冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间43分钟；2.3平衡：使用平衡液（12mm naac+1.7mm hac +0.9m (nh4)2so4，ph5.5）冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；2.4上样：取亲和层析洗脱液回调至ph 5.0的样品，加wfi稀释至纳米抗体的浓度为5mg/ml，再缓慢并持续低速搅拌（80转/min）地加入3m (nh4)2so4调节至电导80ms/cm，调节后需立即上样。上样载量为15g/l，上样温度为20℃，保留时间8分钟；2.5淋洗1：使用平衡液进行淋洗1（12mm naac+1.7mm hac+0.9m(nh4)2so4，ph5.5）冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间8分钟；2.6淋洗2：使用淋洗液2进行淋洗2（10mm naac+70mm hac+0.05m arg+0.6m (nh4)2so4，ph5.0）冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间8分钟；2.7洗脱：使用洗脱液进行洗脱（10mm naac +73mm hac +0.05m arg+10mm (nh4)2so4，ph5.0）冲洗层析柱15倍柱体积，工艺保留时间10分钟；洗脱液收峰参数为峰前250mau/mm~峰后50mau/mm（检测设备型号：akta avant150，供应商cytiva）；得到疏水层析洗脱液；2.8再生：使用wfi冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；2.9消毒：使用0.5m naoh冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；2.10保存：使用0.1m naoh冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟。
69.分别对本实施例的亲和层析洗脱液和疏水层析洗脱液进行质量检测，结果如下表1所示：表1注：质量要求范围为hcp《100ppm和hcd《10ppb。
70.由表1可知，通过疏水层析进行粗纯，hcp、hcd残留可明显下降，分别为41ppm和6ppm，se-hplc主峰纯度可达99%以上，聚集体含量仅为0.5%。
71.对比例1本对比例为一种纳米抗体的层析方法，其步骤同实施例1，主要区别在于：步骤（2）的各步骤中，以氯化钠替代硫酸铵。
72.分别对本对比例的亲和层析洗脱液（同实施例1）和疏水层析洗脱液进行质量检测，结果如下表2所示：表2注：质量要求范围为hcp《100ppm和hcd《10ppb。
73.由表2可知，对比例1无法有效去除hcp和hcd，同时聚集体增多。
74.对比例2本对比例为一种纳米抗体的层析方法，其步骤同实施例1，主要区别在于：步骤（2）
中，采用磷酸盐缓冲体系，并以氯化钠替代硫酸铵和精氨酸。
75.具体地，（2）疏水层析步骤如下：2.1柱冲洗：使用注射用水冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；2.2前消毒：使用0.5m naoh冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间43分钟；2.3平衡：使用平衡液（20mm pb+0.9m nacl，ph7.0）冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；2.4上样：取亲和层析洗脱液回调至ph 5.0的样品，加wfi稀释至纳米抗体的浓度为5mg/ml，再缓慢并持续低速搅拌（80转/min）地加入3m (nh4)2so4调节至电导80ms/cm，调节后需立即上样。上样载量为15g/l，上样温度为20℃，保留时间8分钟；2.5淋洗1：使用平衡液进行淋洗1（20mm pb+0.9m nacl，ph7.0）冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间8分钟；2.6淋洗2：使用淋洗液2进行淋洗2（20mm pb+0.5m nacl，ph 7.0）冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间8分钟；2.7洗脱：使用洗脱液进行洗脱（20mm pb+0.1m nacl，ph 7.0）冲洗层析柱15倍柱体积，工艺保留时间10分钟；洗脱液收峰参数为峰前250mau/mm~峰后50mau/mm（检测设备型号：akta avant150，供应商cytiva）；得到疏水层析洗脱液；2.8再生：使用wfi冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；2.9消毒：使用0.5m naoh冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟；2.10保存：使用0.1m naoh冲洗层析柱4倍柱体积，工艺保留时间4分钟。
76.分别对本对比例的亲和层析洗脱液（同实施例1）和疏水层析洗脱液进行质量检测，结果如下表3所示：表3注：质量要求范围为hcp《100ppm和hcd《10ppb。
77.由表3可知，对比例2无法有效去除hcp和hcd，同时聚集体增多。
78.对比例3本对比例为一种纳米抗体的层析方法，其步骤同实施例1，主要区别在于：步骤2.4中，取亲和层析洗脱液回调至ph 7.0的样品。
79.分别对本对比例的亲和层析洗脱液（同实施例1）和疏水层析洗脱液进行质量检测，结果如下表4所示：表4注：质量要求范围为hcp《100ppm和hcd《10ppb。
80.由表4可知，对比例3无法有效去除hcp和hcd，同时聚集体增多。
81.对比例4本对比例为一种纳米抗体的层析方法，其步骤同实施例1，主要区别在于：步骤2.4中，加入3m (nh4)2so4调节至电导30ms/cm。
82.分别对本对比例的亲和层析洗脱液（同实施例1）和疏水层析洗脱液进行质量检测，结果如下表5所示：表5注：质量要求范围为hcp《100ppm和hcd《10ppb。
83.由表5可知，对比例4无法有效去除hcp和hcd，同时聚集体增多。
84.对比例5本对比例为一种纳米抗体的层析方法，其步骤同实施例1，主要区别在于：步骤（2）的各步骤中，未加入arg。
85.分别对本对比例的亲和层析洗脱液（同实施例1）和疏水层析洗脱液进行质量检测，结果如下表6所示：表6注：质量要求范围为hcp《100ppm和hcd《10ppb。
86.由表6可知，对比例5无法有效去除hcp和hcd，同时聚集体增多。
87.对比例6本对比例为一种纳米抗体的层析方法，其步骤同实施例1，主要区别在于：步骤（2）的各步骤中，arg的浓度增加至0.1m。
88.分别对本对比例的亲和层析洗脱液（同实施例1）和疏水层析洗脱液进行质量检测，结果如下表7所示：表7注：质量要求范围为hcp《100ppm和hcd《10ppb。
89.由表7可知，对比例6无法有效去除hcp和hcd，同时聚集体增多。
90.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
91.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明
的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。