1.本发明属医药领域，具体涉及吲哚菁绿药物中的一种杂质及其制备方法和应用。具体涉及质量控制时作为杂质对照品的用途和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：2.吲哚菁绿(indocyanine green，icg)是一种荧光三碳菁染料，于1955年由柯达实验室研制开发。由于其具有良好的的荧光性质，穿透力强、与血浆蛋白结合率高，可以清晰显示脉络膜图像，从1956年开始用于人类疾病的诊断。icg分子荧光成像技术早期应用于眼科领域，随后该技术开始用于术中导航，识别关键结构和指导实体肿瘤的切除，在神经外科、心脏外科、血管外科术中的血管显影，以及在乳腺癌、胃癌术中前哨淋巴结标记等。目前注射用吲哚菁绿在美国、日本和中国均有上市，用于确定心输出量、肝功能和肝血流量检测、脉络膜血管造影等。
[0003][0004]
药物中的杂质指药物生产、存储或者使用过程中引进或产生的目标化合物以外的所有其他化学物质。药物中的杂质直接影响药物的疗效并可能导致其他不良的毒副作用，必须加以控制。目前在美国药典(usp)和中华人民共和国药典(chp)中有收载吲哚精料及注射用吲哚菁绿的质量标准，均未收载明确的工艺杂质和降解杂质；在相关文献中，亦无明确的杂质检出情况报道。
[0005]
吲哚菁绿遇光与热易变质。在目前的上市产品中均可检出一未知杂质，经考察该化合物可由吲哚菁绿存贮过程中产生。目前为止，未见有关该杂质的分离、结构确认及其用途相关的报道。
[0006]
本发明公开了吲哚菁绿的一个降解杂质及其制备方法和应用。
技术实现要素：[0007]
本发明提供了一种具有如式(ⅰ)所示结构的吲哚菁绿降解杂质。
[0008][0009]
其中，x是钠或钾。
[0010]
上述结构中，其特征在于，化合物ⅰ为1,2-二氢-1,1-二甲基-2-氧代-3h-苯并[e]吲哚-3-丁烷磺酸的钠盐或钾盐，其特征在于钠或钾与1,2-二氢-1,1-二甲基-2-氧代-3h-苯并[e]吲哚-3-丁烷磺酸的配比为a，其中0＜a≤1。
[0011]
所述的化合物形成晶型，其特征在于其粉末x衍射的特征峰为：衍射角2θ为3.43
±
0.1，6.90
±
0.1，10.37
±
0.3。
[0012]
本发明的另一目的在于提供了化合物ⅰ的制备方法。化合物ⅰ为吲哚菁绿的降解杂质，该制备方法其特征在于以式ⅱ所述化合物(吲哚菁绿或其类似物)为原料，发生降解反应，制备得到化合物ⅰ。
[0013][0014]
所述的式ⅱ结构的化合物，其特征在于，r1可以选氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、芳香基、含杂原子基团中任一种或这些基团的组合。
[0015]
进一步，所述的式ⅱ结构化合物，其特征在于，r2可以选氢、钠和钾。
[0016]
进一步，上述制备方法，其特征在于，降解反应在碱、热、光照任一种或其组合条件下进行。
[0017]
进一步，上述制备方法，所述碱可以是无机碱或有机碱中的任一种或其组合。其中优选氢氧化钠和氢氧化钾。
[0018]
进一步，所述反应温度为0℃至300℃。
[0019]
进一步，所述的光照强度为1000lux至100000lux。
[0020]
进一步，所述式i化合物的分离、纯化方法选自重结晶、制备液相分离精制的任一种或其组合。形成的晶型化合物，其粉末x衍射的特征峰为：衍射角2θ为3.43
±
0.1，6.90
±
0.1，10.37
±
0.3。
[0021]
进一步，所述的制备型高效液相色谱分离精制条件为，采用的流动相为甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水中的一种；进行等度或梯度洗脱，收集产品洗脱液，蒸干或冷冻干
燥，即得。
[0022]
进一步，本发明制备的所述化合物ⅰ，可以用做标准品或对照品。可用于吲哚菁绿和吲哚菁绿制剂有关物质检查。具体方法如下：
[0023]
供试品溶液：取本品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中，约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。
[0024]
杂质对照品溶液：取所述的化合物ⅰ适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.5μg的溶液，作为杂质对照品溶液。
[0025]
色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液为流动相a，以甲醇-乙腈(2:48)为流动相b，进行梯度洗脱；柱温为30℃；检测波长为263nm；进样量为20μl。
[0026]
按外标法以峰面积计算。
[0027]
进一步，发明人经过研究，发现所述化合物ⅰ或晶型具有抑制肿瘤细胞的活性；对于该化合物后续在治疗癌症方面的进一步应用具有重要的意义。
[0028]
有益效果
[0029]
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
[0030]
1、本发明制备了一种吲哚菁绿的杂质(化合物ⅰ)，其为吲哚菁绿的降解杂质，在吲哚菁绿原料药和冻干制剂注射用吲哚菁绿的存放过程中均会产生；在原研药(ic-green；akorn,inc.)、日本上市产品(diagnogreen；第一三共株式会社)和国内市售品(瑞度；丹东医创药业有限责任公司)中均有检出该杂质，为上述产品中含量第二的降解杂质；吲哚菁绿溶液在进行光照破坏、高温破坏及碱破坏时，亦会产生明显的该降解杂质峰。该杂质的制备，能够为icg中该杂质的研究提供对照品，为icg的质量控制提供物质基础，便于对icg进行质量控制。
[0031]
2、本发明通过半制备液相色谱、高效液相色谱、高分辨质谱和核磁共振光谱等多种技术手段，对化合物ⅰ进行了制备、分离、浓缩、纯化、检测和鉴定。该方法采用已有生产方法的icg原料药及其类似物为制备原料，该制备原料相对容易获得；制备分离步骤简单可控，易于实现；经结构确证和保留时间比对，证明所制备的化合物即为上述结构，与上市产品中检出的杂质保留行为一致，即为上市产品中的降解杂质。
[0032]
3、本发明首次发现化合物i的新晶型，未见文献报道。
[0033]
4、发明人对所述化合物对癌细胞的活性抑制效果进行了研究，对于该化合物后续在治疗癌症方面的进一步应用具有重要的意义。
附图说明
[0034]
图1本发明所述化合物ⅰms图谱。
[0035]
图2本发明所述化合物ⅰ1
h-nmr图谱。
[0036]
图3本发明所述化合物ⅰ13
c-nmr图谱。
[0037]
图4实施例7中，所述的检测条件下，吲哚菁绿待测物样品及所述化合物ⅰ的hplc色谱图。
[0038]
图5为本发明所述化合物i的xrpd图。
具体实施方式
[0039]
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0040]
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0041]
下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0042]
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0043]
本发明实施例中吲哚菁绿参照专利us2895955a制备；吲哚菁绿有关物质检查的hplc分析方法为自行开发方法。
[0044]
本发明的实施例提供了该化合物的制备方法，对制备的所述化合物进行了结构确证和检测。
[0045]
在其中一个实施例中，对制备的该化合物进行了标定，采用质量平衡法测定了所述化合物的含量。
[0046]
本发明的实施例提供了吲哚菁绿产品有关物质的分析方法，通过高效色谱法根据保留时间进行定位，对该化合物进行识别，以外标法对吲哚菁绿产品中的该杂质进行定量研究。
[0047]
本发明的实施例中还提供了所述化合物抑制肿瘤细胞活性的试验和结果。
[0048]
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述。
[0049]
实施例1
[0050]
取吲哚菁绿自制原料药50g(化合物ⅰ含量0.15％)溶于1500ml甲醇中，静置，过滤，收集滤液。将所得滤液经高压反相制备柱进行分离，具体步骤如下：
[0051]
仪器：高压制备液相为汉邦科技as20005二元分析液相色谱系统(含nu3000uv/vis检测器和np7000分析液相色谱泵)；
[0052]
色谱柱：morphling wd-c18柱(20mm
×
250mm，5μm)；
[0053]
流动相a：水；
[0054]
流动相b：乙腈；
[0055]
按照表1进行梯度洗脱：
[0056]
表1洗脱梯度
[0057][0058]
柱温：25℃；
[0059]
检测波长：263nm；
[0060]
流速：5ml/min；
[0061]
进样量：5ml。
[0062]
收集洗脱液，浓缩干燥得暗棕红色固体，即化合物ⅰ(50mg)。ms图谱如图1所示，1h-nmr图谱如图2所示，
13
c-nmr图谱如图3所示。
[0063]
ms：346.115[m-h]-[0064]1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ8.03-8.01(m,1h),7.97-7.94(m,2h),7.57-7.51(m,2h),7.40-7.38(m,1h),3.82-3.80(t,2h),1.77-1.73(m,2h),1.69-1.65(m,2h),1.55(s,6h)
[0065]
13
cnmr(400mhz,dmso-d6)δ181.22,139.29,129.87,129.48,128.84,128.75,126.93,126.24,123.15,121.85,110.61,50.85,44.81,26.63,23.69,22.38。
[0066]
粉末x衍射的特征峰为：衍射角2θ为3.43
±
0.1，6.90
±
0.1，10.37
±
0.3。
[0067]
实施例2
[0068]
取吲哚菁绿自制原料药5g溶于100ml水中，搅拌使其充分溶解，于4500lux光照强度下条件下搅拌反应72小时。浓缩，将所得油状物按实施例1所述方法进行分离，收集洗脱液，浓缩干燥得暗棕红色固体，即化合物ⅰ(11mg)。波谱数据同实施例1。
[0069]
实施例3
[0070]
取1,2-二氢-1,1-二甲基-2-亚甲基-3h-苯并[e]吲哚-3-丁烷磺酸5g溶于150ml甲醇中，加入10％浓度的氢氧化钠水溶液10ml，于50℃条件下搅拌至反应完全。静置，过滤，收集滤液，得到待分离液。将所得分离液按实施例1所述方法进行分离，收集洗脱液，浓缩干燥得暗棕红色固体，即化合物ⅰ(202mg)，波谱数据同实施例1。
[0071]
实施例4
[0072]
取2-[2-(乙酰苯基氨基)乙烯基]-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1h-苯并[e]吲哚5g溶于150ml甲醇中，加入4.4g三乙胺，于60℃条件下搅拌反应10小时。静置，过滤，收集滤液，浓缩得到待分离液。将所得分离液按实施例1所述方法进行分离，收集洗脱液，浓缩干燥得暗棕红色固体，即化合物ⅰ(50mg)，波谱数据同实施例1。
[0073]
实施例5
[0074]
取2-[2-[4-(二乙氨基)苯基]乙烯基]-3-[4-(甲氧基磺酰基)丁基]-1,1-二甲基-1h-苯并[e]吲哚2g溶于50ml水中，加入10％浓度的氢氧化钾水溶液50ml，搅拌使其充分溶解，于50℃条件下搅拌反应10小时。静置，过滤，收集滤液，得到待分离液。将所得分离液按实施例1所述方法进行分离，收集洗脱液，浓缩干燥得暗棕红色固体，即化合物ⅰ(130mg)，波谱数据同实施例1。
[0075]
实施例6
[0076]
取2-[3-[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-2h-苯并[e]吲哚-2-亚烷基]-1-丙烯-1-基]-1,1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1h-苯并[e]吲哚，内盐5g溶于50ml水中，加入0.54g碳酸氢钠，搅拌使其充分溶解，于50℃条件下搅拌反应10小时。静置，过滤，收集滤液，得到待分离液。将所得分离液按实施例1所述方法进行分离，收集洗脱液，浓缩干燥得暗棕红色固体，即化合物ⅰ(18mg)，波谱数据同实施例1。
[0077]
实施例7化合物ⅰ作为对照品在吲哚菁绿有关物质检查中的应用
[0078]
样品：吲哚菁绿原料药，实验室自制，20051103批、21032401批；
[0079]
注射用吲哚菁绿：实验室自制，21032401批、20092104批；
[0080]
国外上市品：ic-green，美国akron inc，061179a批；
[0081]
diagnogreen，日本第一三共株式会社，qha0133批。
[0082]
国内上市制剂：瑞度，丹东医创药业有限责任公司，19061213批。
[0083]
对照品：采用实施例2所述方法进行制备，21011401批。
[0084]
其中对照品采用质量平衡法进行标定其含量，为93.11％。
[0085]
色谱条件：
[0086]
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
[0087]
色谱柱：welch xtimate c18，4.6
×
250mm，5μm；
[0088]
流动相a：10mmol/l的磷酸二氢钠溶液，磷酸调节ph值至4.6；
[0089]
流动相b：甲醇-乙腈(2∶48)；
[0090]
按照下表2进行梯度洗脱：
[0091]
表2洗脱条件
[0092][0093][0094]
柱温：30℃；
[0095]
流速：1.0ml/min；
[0096]
紫外波长：263nm；
[0097]
进样体积：20μl；
[0098]
溶剂：甲醇。
[0099]
对照品溶液：取杂质ⅰ适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.5μg的溶液。
[0100]
供试品溶液：取待测吲哚菁绿适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含吲哚菁绿0.5mg的溶液。
[0101]
对照品溶液、1批自制制剂及原研产品(ic-green)的色谱图如图4所示：
[0102]
按外标法，供试品溶液杂质ⅰ检测出结果见下表3。
[0103]
表3自制制剂及原研产品比较试验
[0104][0105]
实施例8mts测定细胞增殖方法检测pc-3人源前列腺癌细胞增殖抑制实验
[0106]
将pc-3人源前列腺癌细胞制备成细胞混悬液，以新鲜细胞培养液稀释成3.0
×
104cell/ml密度后接种于96孔板中，接种体积为100μl/孔，将培养基于培养箱中培养过夜后取出。将所述化合物以甲醇溶解，并以细胞培养液进行稀释后加入培养基中，100μl/孔，振荡混匀，每个药物浓度至少四个复孔；对照组仅加入相应的溶剂，分别于37℃培养48小时后取出。弃去培养液，每空补加200μl培养液，并加入0.5％的mts溶液20μl，再次置培养基中培养4h后取出。弃去培养液，每孔加入dmso 200μl，震荡10min使甲瓒完全溶解；在570nm波长下检测样本吸光度。根据吸光度计算，细胞增殖抑制率(％)＝(1-od
实验组
/od
溶剂组
)
×
100％。实验结果见表4所示，化合物i对pc-3人源前列腺癌细胞增殖活性的有明显的抑制效果。
[0107]
表4所述化合物抑制pc-3人源前列腺癌细胞增殖实验结果
[0108]