噬菌体裂解酶、其嵌合物及应用的制作方法

噬菌体裂解酶、其嵌合物及应用
1.本技术主张如下优先权：cn202110187030.8，申请日2021.02.08。
技术领域
2.本发明涉及医药生物领域，具体提供一种具有抗痤疮丙酸杆菌活性的噬菌体裂解酶、其嵌合物及应用。


背景技术：

3.痤疮是一种皮肤炎症性疾病，尤其是在面部、颈部、肩膀、胸部、背部和上臂。毛囊皮脂腺单元由于被过度分泌的油脂堵塞及致病性痤疮丙酸杆菌(cutibacterium acnes，简称c.acnes,下同)的增殖导致的死皮细胞积累而产生炎症。根据美国国家健康研究所的数据，11到30岁的人群中有80％都有不同程度的痤疮。痤疮通常开始于青春期，可能持续到四五十岁。不同因素可能会引起痤疮的爆发，例如压力、激素水平的变化、过敏原等。2010年的全球疾病负担研究估计，痤疮影响了全球9.4％的人口，并将其列为世界第八大最流行的疾病。据美国皮肤学会估计，在2013年痤疮患者治疗和生产力损失相关的费用超过了12亿美元。虽然它本身很少危及生命，但它会造成皮肤上持久的疤痕和患者相当大的情绪困扰。
4.目前治疗轻度痤疮的选择是使用含有过氧化苯甲酰、间苯二酚、水杨酸和硫等化学物质的非处方外用药物，以及处方外用药物，如抗生素、过氧化苯甲酰、壬二酸、氨苯砜、皮质类固醇和称为类视黄醇(retinoids)的维生素a衍生物。中至重度病情可采用外用处方药或口服药物治疗。干预的目的是为了去除死皮细胞和多余的油脂，以使毛囊皮脂腺单元畅通并且减少细菌负荷。由于痤疮是一种慢性疾病，需要长时间的治疗并且有时需要防止复发。然而，现有的治疗方案没有一种适合长期治疗。当延长这些药物的使用时间，即使是最温和的化学物质也会引起皮肤的过敏反应和刺激，导致皮肤干燥、起皮、龟裂等。由于耐药性痤疮丙酸杆菌在世界上越来越普遍，抗生素治疗选择也越来越局限。此外，长期使用抗生素已被证明会通过对耐药细菌种类施加选择压力而干扰微生物群的稳定状态。这转而会引发无数的并发症，例如菌群失调和免疫异常。有文献表明，在抗生素治疗过程中痤疮患者的皮肤葡萄球菌菌群会由大多数抗生素敏感转化为大多数耐药。不仅是患者本人，患者的密切接触者也会受到多药耐药性细菌的影响。值得注意的是，长期接受抗生素治疗的痤疮患者患上呼吸道感染的可能性增加两倍。因此，现在迫切需要一种更安全、更有效、更适合长期使用的治疗方案。一种这样的方案是病原体特异性抗菌药，其能够特异性杀死痤疮丙酸杆菌而不会影响其他共生菌，无需考虑抗生素耐药性。
5.此外，痤疮丙酸杆菌还与一系列侵袭性感染有关，包括术后肩部感染、椎间盘感染等。在此类感染中，痤疮丙酸杆菌表现出慢性进展性生物膜类感染。在生物膜中发现的细菌对抗生素具有固有耐药性。一种具有强烈抗生物膜特性的痤疮丙酸杆菌杀菌剂是治疗此类感染的理想药物。
6.一种此类病原体特异性抗菌药的备选药物是噬菌体细胞内溶素。噬菌体用这类酶破坏细胞壁稳定性进行裂解，从而从细胞内部释放噬菌体子代。它们被归类为肽聚糖水解
酶，可以断裂细菌肽聚糖中的各种键。除了少数例外，每种裂解酶的目标细菌都属于单一的属或种。已经证明，重组的抗革兰氏阳性菌裂解酶是能够引起低渗裂解的有效杀菌剂(如抗若干种链球菌的plyc，抗炭疽芽孢杆菌的plyg等)。考虑到裂解酶为了持续成功感染细胞在数十亿年中受到选择性进化压力，目标肽聚糖键高度保守，不太可能被细菌轻易改变。这个特性导致目标细菌对裂解酶产生耐药性的可能很小，因此适合长期治疗使用。迄今为止还未检测出对各自的噬菌体裂解酶的细菌耐药性。通常，抗革兰氏阳性菌的裂解酶是由一个或两个n-末端催化结构域(cd)和一个c-末端细胞壁结合结构域(bd)组成，结构域间有不同长度的接头(linkers)。裂解酶作为模块蛋白质，可以通过配对来自不同裂解酶的催化结构域和结合结构域来产生嵌合裂解酶。接头的长度和序列也是可变的。然而，开发作为抗菌剂的裂解酶的主要瓶颈是不能可溶性表达高活性裂解酶。事实上，到目前为止没有报道过高水平可溶性表达并能有效杀死痤疮丙酸杆菌的裂解酶。
7.专利cn102482655a公开了一种抗微生物剂，其由具有降解革兰氏阳性细菌细胞壁的活性的细胞内溶素和在n端或c端或两端融合于该细胞内溶素的两亲肽段构成，能够用于治疗或预防革兰氏阳性细菌感染，作为诊断手段或作为美容用物质的用途。但是，该专利中虽然描述了pa6具有抗p.acnes dsmz 1897株和dsmz 16379株活性，但并未提供初始cfu/ml；此外，pa6不能解决提高可溶性表达水平的问题。
8.综上所述，对治疗痤疮丙酸杆菌的新治疗方式显然还有很大的需求，并且迄今为止没有报道过适合工业规模生产的高痤疮丙酸杆菌杀伤活性的噬菌体裂解酶。噬菌体裂解酶能够特异性、有效地杀死痤疮丙酸杆菌，同时保持其他共生细菌完整无损，可以提供一种安全有效的痤疮解决方案，适合长期使用，而不会有很高的生态失调和获得性耐药风险。


技术实现要素：

9.针对以上技术现状，本发明提供了具有抗痤疮丙酸杆菌活性的噬菌体裂解酶、其嵌合物及应用。具体发明如下：
10.本发明提供了一种噬菌体裂解酶或其嵌合物在制备预防、治疗或改善痤疮或由痤疮丙酸杆菌引起的感染或与痤疮丙酸杆菌有关的病症的药物、化妆品或医疗设备中的应用，所述噬菌体裂解酶包括来源于类诺卡氏菌科(nocardioidaceae)和丙酸杆菌科(propionibacteriaceae)细菌的噬菌体裂解酶。
11.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述类诺卡氏菌科(nocardioidaceae)细菌包括微白霜菌属(micropruina)、产丙酸单孢菌属(propionicimonas)、产丙酸细胞菌属(propionicicella)、弗莱德门氏菌属(friedmanniella)细菌；所述丙酸杆菌科(propionibacteriaceae)细菌包括产丙酸菌属(propioniferax)、海马球菌属(mariniluteicoccus)、颗粒球菌属(granulicoccus)、瑙曼氏菌属(naumannella)、棒状丙酸菌属(propioniciclava)、光球菌属(auraticoccus)、小月菌属(microlunatus)、河口微菌属(aestuariimicrobium)、黄球菌属(luteococcus)、四合球菌属(tessaracoccus)、布克劳氏菌属(brooklawnia)、产丙酸微球菌属(propionimicrobium)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、痤疮丙酸杆菌属(cutibacterium)、酸性丙酸杆菌属(acidipropionibacterium)、或假丙酸杆菌属(pseudopropionibacterium)细菌，优选丙酸杆菌属(propionibacterium)、痤疮丙酸杆菌属(cutibacterium)、酸性丙酸杆菌属
(acidipropionibacterium)、或假丙酸杆菌属(pseudopropionibacterium)细菌。
12.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述噬菌体裂解酶包括来源于痤疮丙酸杆菌(cutibacterium acnes)、肱丙酸杆菌(propionibacterium humerusii)、贪婪丙酸杆菌(cutibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(cutibacterium granulosum)、特氏丙酸杆菌(acidipropionibacterium thoenii)、詹氏丙酸杆菌(acidipropionibacterium jensenii)、产丙酸丙酸杆菌(acidipropionibacterium acidipropionici)、潮汐滩菌(aestuariimicrobium kwangyangense)、细粒球菌(granulicoccus phenolivorans)、积磷小月菌(microlunatus phosphovorus)、丙酸丙酸杆菌(pseudopropionibacterium propionicum)、四合球菌(tessaracoccus sp.)、极底产丙酸细胞菌(propionicicella superfundia)、费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii)、费氏丙酸杆菌费氏亚种(propionibacterium freudenreichii subsp.freudenreichii)、费氏丙酸杆菌舍氏亚种(propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii)、产酸丙酸杆菌(propionibacterium acidifaciens)、嗜淋巴丙酸杆菌(propionibacterium lymphophilum)、丙酸杆菌属细菌(propionibacteriaceae bacterium)、丙酸杆菌分类群192(propionibacterium sp.oral taxon 192)、无毒产丙酸菌(propioniferax innocua)、盐藻瑙曼氏菌(naumannella halotolerans)、慢生棒状丙酸菌(propioniciclava tarda)、糖原微白霜菌(micropruina glycogenica)、淡水产丙酸单孢菌(propionicimonas paludicola)、纪念性光球菌(auraticoccus monumenti)、日本黄球菌(luteococcus japonicus)、油田四合球菌(tessaracoccus oleiagri)、本迪戈四合球菌(tessaracoccus bendigoensis)、拉帕迪卡四合球菌(tessaracoccus lapidicaptus)、微嗜气丙酸杆菌(acidipropionibacterium microaerophilum)、橄榄体丙酸杆菌(acidipropionibacterium olivae)、丹诺氏丙酸杆菌(acidipropionibacterium damnosum)细菌的噬菌体裂解酶。
13.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述噬菌体裂解酶包括来源于詹氏丙酸杆菌(acidipropionibacterium jensenii)、特氏丙酸杆菌(acidipropionibacterium thoenii)、产丙酸丙酸杆菌(acidipropionibacterium acidipropionici)、微嗜气丙酸杆菌(acidipropionibacterium microaerophilum)、橄榄体丙酸杆菌(acidipropionibacterium olivae)、丹诺氏丙酸杆菌(acidipropionibacterium damnosum)、痤疮丙酸杆菌(cutibacterium acnes)、贪婪丙酸杆菌(cutibacterium avidum)、颗粒丙酸杆菌(cutibacterium granulosum)、丙酸丙酸杆菌(pseudopropionibacterium propionicum)细菌的噬菌体裂解酶。
14.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述噬菌体裂解酶具有seq id no:1～seq id no:28中任一所示的氨基酸序列；
15.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述噬菌体裂解酶具有seq id no:29～seq id no:56中任一所示的核苷酸序列；
16.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述噬菌体裂解酶优选具有seq id no:10所示的氨基酸序列的pacl10；
17.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述噬菌体裂解酶优选具有seq id no:38所示的核苷酸序列的pacl10。
id no:64、seq id no:65、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:77、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:91、seq id no:93、seq id no:95、seq id no:97、seq id no:98、seq id no:99、seq id no:100、seq id no:102、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106、seq id no:107、seq id no:108、seq id no:110、seq id no:111、seq id no:113、seq id no:114、seq id no:117、seq id no:118、seq id no:121、seq id no:122、seq id no:125、seq id no:127、seq id no:128、seq id no:131、seq id no:132、seq id no:133、seq id no:135或seq id no:136中所示的氨基酸序列；
35.所述结合结构域具有seq id no:60、seq id no:62、seq id no:68、seq id no:72、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:88、seq id no:89、seq id no:90、seq id no:92、seq id no:94、seq id no:96、seq id no:101、seq id no:103、seq id no:109、seq id no:112、seq id no:115、seq id no:116、seq id no:119、seq id no:120、seq id no:123、seq id no:124、seq id no:126、seq id no:129、seq id no:130、seq id no:134、seq id no:137、seq id no:138、或seq id no:139所示的氨基酸序列。
36.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述催化结构域具有seq id no:140、seq id no:141、seq id no:142、seq id no:144、seq id no:146、seq id no:147、seq id no:148、seq id no:149、seq id no:150、seq id no:152、seq id no:153、seq id no:154、seq id no:156、seq id no:157、seq id no:160、seq id no:163、seq id no:164、seq id no:168、seq id no:169、seq id no:170、seq id no:174、seq id no:176、seq id no:178、seq id no:180、seq id no:181、seq id no:182、seq id no:183、seq id no:185、seq id no:187、seq id no:188、seq id no:189、seq id no:190、seq id no:191、seq id no:193、seq id no:194、seq id no:196、seq id no:197、seq id no:200、seq id no:201、seq id no:204、seq id no:205、seq id no:208、seq id no:210、seq id no:211、seq id no:214、seq id no:215、seq id no:216、seq id no:218、seq id no:219、所示的核苷酸序列；
37.所述结合结构域具有seq id no:143、seq id no:145、seq id no:151、seq id no:155、seq id no:158、seq id no:159、seq id no:161、seq id no:162、seq id no:165、seq id no:166、seq id no:167、seq id no:171、seq id no:172、seq id no:173、seq id no:175、seq id no:177、seq id no:179、seq id no:184、seq id no:186、seq id no:192、seq id no:195、seq id no:198、seq id no:199、seq id no:202、seq id no:203、seq id no:206、seq id no:207、seq id no:209、seq id no:212、seq id no:213、seq id no:217、seq id no:220、seq id no:221、或seq id no:222所示的核苷酸序列。
38.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述嵌合物具有seq id no:223～seq id no:282中任一所示的氨基酸序列；优选seq id no:258、seq id no:259、seq id no:260、seq id no:271或seq id no:272所示的氨基酸序列；更优选seq id no:260或seq id no:271所示的氨基酸序列；
39.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述嵌合物具有seq id no:283～seq id no:342中任一所示的核苷酸序列；优选seq id no:316、seq id no:317、seq id no:318、seq id no:329或seq id no:330所示的核苷酸序列；更优选seq id no:318或seq id no:
329所示的核苷酸序列。
40.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述由痤疮丙酸杆菌引起的感染包括侵入性感染、术后感染和/或器械相关的感染。
41.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述器械相关的感染包括关节假体、分流管和人工心脏瓣膜相关的感染。
42.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述感染包括骨骼和/或关节的感染，尤其是术后肩部感染，以及口腔、眼、椎间盘和脑部的感染。
43.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述与痤疮丙酸杆菌有关的病症包括导致癌症的前列腺炎、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、肥大、骨炎)综合征、结节病、或坐骨神经痛。
44.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述医疗设备包括用于将裂解酶或其嵌合物释放到受影响区域的任何设备，优选施加至皮肤表面的夹具或贴剂或喷雾剂，使用微针增强裂解酶或其嵌合物的皮肤渗透性的设备，美容专业人员使用的将裂解酶或其嵌合物专门施加至受痤疮影响的毛囊上的细针，或其他类似的设备。
45.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述医疗设备包括将将裂解酶或其嵌合物固定在易于感染痤疮丙酸杆菌的位置中的假体装置上，优选用于特别容易感染痤疮丙酸杆菌的肩部手术中的假体植入物。
46.本发明还提供了前述应用中所述的噬菌体裂解酶嵌合物。作为实施方案之一，所述嵌合物具有seq id no:223～seq id no:282中任一所示的氨基酸序列；优选seq id no:258、seq id no:259、seq id no:260、seq id no:271或seq id no:272所示的氨基酸序列；更优选seq id no:260或seq id no:271所示的氨基酸序列；
47.本发明的应用中，作为实施方案之一，所述嵌合物具有seq id no:283～seq id no:342中任一所示的核苷酸序列；优选seq id no:316、seq id no:317、seq id no:318、seq id no:329或seq id no:330所示的核苷酸序列；更优选seq id no:318或seq id no:329所示的核苷酸序列。
48.本发明还提供了一种前述嵌合物的制备方法，包括：
49.(1)合成结构域序列及扩增结构域序列的引物；
50.(2)采用taq dna聚合酶pcr扩增结构域序列；
51.(3)pcr产物凝胶纯化，与表达质粒pet28连接；
52.(4)重组质粒转移到大肠杆菌bl21(de3)；
53.(5)培养含有重组质粒的大肠杆菌bl21(de3)，诱导表达，离心收集细胞，裂解，纯化得到所述嵌合物。
54.本发明的制备方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：
55.将含有重组嵌合裂解酶表达质粒的大肠杆菌bl21(de3)置于自诱导培养基中在37℃、300rpm下培养至od
600
达到0.6-0.8，随后在18℃、300rpm下，持续培养16-18小时。离心收集细胞，重悬于50mm ph 7.4的磷酸钠中，高压均质裂解。裂解液再次离心以收集可溶性粗裂解液。将可溶性组分与等体积的5m nacl混合，混合物上样到疏水柱中。上样后，用5倍柱体积的20mm磷酸钠(ph 7.4)、2.5m nacl洗涤柱子。然后用10mm磷酸钠(ph 7.4)洗脱重组嵌合裂解酶。可选择地，本领域技术人员可以对表达和纯化进行优化，可以在不同的温度、通气和诱导时间下使用不同浓度的iptg在lb中表达裂解酶。可以将细胞重悬于不同的缓冲液
中以提高溶解度，并通过机械或化学手段进行裂解。可以采用不同的蛋白质色谱方法来纯化裂解酶。可以优化这些变量以获得更好的裂解酶蛋白产量。
56.本发明还提供了含有前述嵌合物的制剂，所述制剂进一步包含抗生素、其他裂解酶、或非活性赋形剂。
57.本发明还提供了编码前述嵌合物的氨基酸序列，与前述序列相似度80％及以上、85％及以上、90％及以上、95％及以上或99％及以上的氨基酸序列，或具有相同官能团的替代氨基酸序列。作为示例性的说明，本发明还提供了与前述序列相似度80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。
58.作为实施方案之一，所述替代氨基酸序列为使用同一组氨基酸中的氨基酸的保守替换，所述氨基酸组包括：
59.脂肪族的：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；
60.含羟基或硫/硒的：丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸；
61.环状的：脯氨酸；
62.芳族的：苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；
63.碱性的：组氨酸、赖氨酸、精氨酸；
64.酸性的以及它们的酰胺：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。
65.本发明还提供了编码前述嵌合物的核苷酸序列，或其同义密码子序列。
66.本发明还提供了前述嵌合物用作细菌裂解的试剂的应用，所述细菌裂解用于使用基于pcr的试剂盒进行dna提取和分型。
67.本发明还提供了前述嵌合物用作非生物表面上的消毒剂或灭菌剂的应用，所述消毒剂或灭菌剂通过去除浮游形式或生物膜中的痤疮丙酸杆菌以防止感染，优选在手术过程中对手术设备或假体植入装置进行消毒。
68.本发明还提供了前述嵌合物、前述嵌合物中的单个结合结构域，或前述嵌合物中的相似或不同的结合结构域串联的组合在制备用于痤疮丙酸杆菌的诊断工具中的应用，所述裂解酶、嵌合物或结合结构域与检测标志物联合使用。
69.作为实施方案之一，所述裂解酶、嵌合物或结合结构域与信号分子通过基因融合或化学偶联形成融合物。
70.作为实施方案之一，所述融合物用于通过荧光或其他手段直接检测显微镜载玻片上的痤疮丙酸杆菌，用于通过免疫组织化学标记痤疮丙酸杆菌，用作elisa测定中的检测试剂，用作western blot上的检测试剂，用于与在macs或其他pull-down测定中的磁珠连接，或用于抗体作为检测试剂的测定中的检测试剂。作为实施方案之一，所述信号分子包括蛋白质或化学荧光染料、蛋白质标签、酶、抗生物素蛋白、链霉亲和素、卵清蛋白、生物素、对点击化学标记敏感的标签、内含肽、或能够引起产生信号的二级蛋白质或分子募集的其他分子，
71.所述荧光染料包括gfp、rfp、mcherry、fitc、tritc、alexafluor 488、cy3或cy5；
72.所述蛋白质标签包括flag-标签、myc-标签、halo-标签、his-标签、或能够与抗体或其他高亲和力分子结合产生信号的任何其他标签；
73.所述酶包括萤火虫荧光素酶、β-内酰胺酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、或引起
诸如光、颜色变化、底物沉积或其他能够在试验中检测到的反应的任何其他的酶。
74.本发明还提供了前述嵌合物中的催化结构域在制备治疗痤疮丙酸杆菌感染的药物中的应用，所述催化结构域与寻靶模块结合。
75.本发明提供了用于预防和治疗痤疮丙酸杆菌感染和皮肤定植以及与这种感染或定植相关的痤疮病变的组合物和方法。在广泛的方面，本发明提供了裂解酶的用途和应用，所述裂解酶具有对皮肤相关的生物体的广泛杀伤活性，所述生物体涉及痤疮病变的发生或恶化以及痤疮病变的继发感染，包括但不限于丙酸杆菌属(propionibacterium)、痤疮丙酸杆菌属(cutibacterium)、酸性丙酸杆菌属(acidipropionibacterium)、假丙酸杆菌属(pseudopropionibacterium)的细菌。特别地，本发明描述了用于皮肤中已建立的细菌群落的去定植、分散和去除的方法，特别着重于痤疮丙酸杆菌(cutibacterium acnes，以前称作propionibacterium acnes)。此外，本发明还提供了生产嵌合裂解酶的方法，所述嵌合裂解酶包含来自不同裂解酶的催化结构域和结合结构域，从而产生各种有利的特性，包括但不限于改善的活性、宿主范围、表达、溶解性、稳定性或更适合于商品化。
76.根据本发明，在本发明的方法和应用中使用了来源于丙酸杆菌属(propionibacterium)、痤疮丙酸杆菌属(cutibacterium)、酸性丙酸杆菌属(acidipropionibacterium)、假丙酸杆菌属(pseudopropionibacterium)细菌的噬菌体裂解酶。表2提供了本发明中使用的裂解酶和多肽。
77.在本发明的一个方面，seq id no:1～seq id no:28中所示的裂解酶由seq id no:29～seq id no:56中所示的核苷酸序列编码。
78.本发明还提供了一种在不同噬菌体裂解酶的结合结构域和催化结构域之间产生嵌合体的方法。seq id no:57～seq id no:139示出了提供编码本发明所述来源于噬菌体裂解酶的催化结构域和结合结构域的多肽序列的实例的非限制性序列表。
79.在本发明的一个方面，seq id no:57～seq id no:139中所示的催化结构域和结合结构域由seq id no:140～seq id no:222中示出的核苷酸序列编码。
80.本发明还提供了如本发明所述的通过配对不同裂解酶的催化结构域和结合结构域而产生的嵌合裂解酶的非限制性实例。seq id no:223～seq id no:282提供了由本发明所述方法产生的抗痤疮丙酸杆菌活性的嵌合裂解酶的非限制性序列表。
81.在本发明的一个方面，使用seq id no:283～seq id no:342中所述的核苷酸序列产生本发明所述的嵌合裂解酶。
82.在本发明的一个方面，所述多肽序列由插入到表达载体pet28中的核苷酸序列编码。
83.在本发明的一个方面，编码本发明所述多肽的表达载体在大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)菌株中表达。
84.此外，本发明提供了一种筛选和评价噬菌体裂解酶抗痤疮丙酸杆菌活性的方法。
85.此外，本发明证明了确定的噬菌体裂解酶抗痤疮丙酸杆菌的活性。
86.在本发明的一个方面，用于治疗丙酸杆菌的裂解酶为pacl10。本发明提供了一种表达和纯化pacl10的方法。此外，本发明证明pacl10对痤疮丙酸杆菌具有较高的抗菌活性。
87.通过最小抑菌浓度(mic)试验和时间杀菌试验评价了pacl10对一系列不同进化枝的痤疮丙酸杆菌株的活性，结果一致表明pacl10具有很高的有效性。
88.本发明中产生的噬菌体裂解酶及其衍生物适合工业规模生产，能够特异性、有效地杀死痤疮丙酸杆菌，同时保持其他共生细菌完整无损，可以提供一种安全有效的痤疮解决方案，适合长期使用，而不会有很高的生态失调和获得性耐药风险。本发明中产生的噬菌体裂解酶及其衍生物具有如下优点：
89.(1)能够杀死痤疮丙酸杆菌(c.acnes)而不损伤天然菌群。
90.(2)与需要很长时间才能起效的抗生素相比，活性迅速(几分钟之内)。
91.(3)没有耐药性。细菌会迅速对抗生素产生耐药性，因此裂解酶是一种解决方案。c.acnes是一种强烈分泌生物膜的生物。即使对于对抗生素敏感的生物，当以生物膜形式发现它们时，它们会对抗生素产生耐药性。裂解酶对生物膜高度有效。
92.(4)与其他裂解酶相比，本发明更有效——在其他测定中mic低，活性高。
93.(5)能够可溶性表达，其产量适于大规模和工业生产。
94.(6)对所有进化枝的p.acnes.都有效。
95.定义
96.由于scholz等对丙酸杆菌属(propionibacterium)的重新分类，新旧名称对照的非限制性实例如下表1所示：
97.表1
[0098][0099][0100]
本领域人员应该理解，细菌的重新分类、新旧名称、中文名称等不应影响对该细菌的认定，本发明无论采用新名称或旧名称，其代表为同一菌种。
[0101]
本发明涉及序列的非限制性实例如下表2：
[0102]
表2
[0103]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107]
[0108][0109]
本发明中所述天然接头的非限制性示例如下表3：
[0110]
表3
[0111]
[0112][0113]
本发明中所述合成接头的非限制性示例如下表4：
[0114]
表4
[0115]
序号接头名称氨基酸序列1(gggs)n，1≤n≤8，n为整数—2(ggggs)n，1≤n≤8，n为整数—3(gggggs)n，1≤n≤8，n为整数—4(gly)
3-8
—5(eaaak)n，1≤n≤8，n为整数—6papapseq id no:3937aeaaakeaaakaseq id no:3948(ala-pro)n，1≤n≤15，n为整数—9a(eaaak)nalea(eaaak)na，1≤n≤8，n为整数—10vsqtskltraetvfpdvseq id no:39511plg lwaseq id no:39612rvlaeaseq id no:39713edvvccsmsyseq id no:39814ggiegrgsseq id no:39915trhrqprgweseq id no:40016agnrvrrsvgseq id no:40117rrrrrrrrrseq id no:40218gflgseq id no:40319kesgsvsseqlaqfrsldseq id no:40420egkssgsgseskstseq id no:40521gsagsaagsgefseq id no:406
附图说明
[0116]
图1实施例3中示出了所选裂解酶对痤疮丙酸杆菌的有效杀伤作用。裂解酶在含有iptg的lb琼脂上的大肠杆菌bl21(de3)中表达，并通过大肠杆菌渗透释放。大肠杆菌周围的透明区或晕圈表明，表达的裂解酶可以抑制生长或杀死嵌入在琼脂覆盖层中的痤疮丙酸杆菌。
[0117]
图2实施例3中示出了由含有诱导的所选裂解酶的大肠杆菌粗裂解液在痤疮丙酸杆菌覆盖层上形成的清除区。
[0118]
图3实施例4中证明pacl10可以可溶性表达和纯化。所有样品在5-12％的三甘氨酸凝胶中在150v运行50分钟，并用考马斯亮蓝染色。pacl10使用pet表达系统在大肠杆菌bl21(de3)中表达，并通过疏水作用纯化。洗脱级分示出了在29.4kda处的纯化的pacl10。
[0119]
图4实施例7示出了pacl10降低痤疮丙酸杆菌34a菌株的cfu/ml的动力学。当mic为6.4μg/ml、2x mic为12.8μg/ml时,cfu/ml可分别在3小时和2小时内降至检测限以下。
[0120]
图5示出了用于mic测定的单步纯化的裂解酶。上样至5-12％tris-hcl sds凝胶的裂解酶浓度为：0.62mg/ml pacl10,1.41mg/ml pacl390,2.12mg/ml pacl391,2.10mg/ml pacl392,1.49mg/ml pacl403和1.60mg/ml pacl404。
[0121]
图6示出了通过混合模式和离子交换色谱法纯化的pacl392。
[0122]
图7示出了pacl392相对于菌株10的杀菌活性。
[0123]
图8示出了通过混合模式色谱法纯化的pacl403。
[0124]
图9示出了pacl403相对于菌株10的杀菌活性—od减少。
[0125]
图10示出了pacl403相对于菌株10的杀菌活性—cfu减少。
[0126]
图11示出了pacl403相对于生物膜相关的菌株10的杀菌活性。
具体实施方式
[0127]
以下实施例和/或实验例仅用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。采用标准实验方法进行实验得出实施例所示结果。
[0128]
实施例1
[0129]
通过分析丙酸杆菌科细菌基因组中前噬菌体的序列，我们鉴定出可以可溶性表达和纯化的痤疮丙酸杆菌噬菌体裂解酶。表达噬菌体裂解酶的基因序列由sangon合成，并与表达质粒pet28连接。然后将每种重组质粒转入大肠杆菌bl21(de3)菌株。
[0130]
实施例2
[0131]
嵌合物构建为n-末端催化结构域(cd)和c-末端结合结构域(bd)，其间有可变长度的接头(linker)。通过使用ncbi恒定区数据库和用于计算机模拟蛋白质结构预测的raptorx网络服务器进行序列分析来鉴别结构域。催化结构域具有全c-末端、半c-末端或无c-末端接头。同样的，结合结构域具有全n-末端、半n-末端或无n-末端连接。扩增结构域序列的引物由genecreate合成。采用taq dna聚合酶pcr在55℃退火温度下扩增结构域序列。pcr产物经凝胶纯化，与表达质粒pet28连接。然后将重组质粒转移到大肠杆菌bl21(de3)。
[0132]
实施例3
[0133]
痤疮丙酸杆菌覆盖试验证实了裂解酶的抗菌活性。简单地说，将含有重组裂解酶质粒的大肠杆菌bl21(de3)克隆置于含iptg的lb琼脂上进行诱导。一旦裂解酶过表达，大肠杆菌克隆就会渗透释放裂解酶。包埋有痤疮丙酸杆菌的软琼脂被覆盖并培养以使痤疮丙酸杆菌生长。活性裂解酶的存在会在大肠杆菌周围形成透明区或晕圈。实验结果见图1。
[0134]
在类似的试验中，含有重组裂解酶质粒的大肠杆菌bl21(de3)克隆在液体培养基中诱导。离心收集细胞，在50mm磷酸钠ph 7.4缓冲液中超声裂解。裂解液离心分离可溶和不溶性组分。将可溶性粗裂解液在包埋有痤疮丙酸杆菌的软琼脂上点样。在培养以使痤疮丙酸杆菌生长后，可溶性粗裂解物中的活性裂解酶形成了清除区。实验结果见图2。
[0135]
实施例4
[0136]
pacl10的表达和纯化
[0137]
pacl10表达及纯化如下。简单地说，将含有重组pacl10表达质粒的大肠杆菌bl21(de3)置于自诱导培养基中在37℃、300rpm下培养至od
600
达到0.6-0.8，随后18℃、300rpm，持续培养16-18小时。离心收集细胞，重悬于50mm ph 7.4的磷酸钠中，高压均质裂解。裂解液再次离心以收集可溶性粗裂解液。将可溶性组分与等体积的5m nacl混合，混合物上样到疏水柱中。上样后，用5倍柱体积的20mm磷酸钠(ph 7.4)、2.5m nacl洗涤柱子。然后用10mm磷酸钠(ph 7.4)洗脱pacl10。实验结果见图3。
[0138]
实施例5
[0139]
以类似于pacl10的方式表达和纯化嵌合裂解酶。将含有重组嵌合裂解酶表达质粒的大肠杆菌bl21(de3)置于自诱导培养基中在37℃、300rpm下培养至od
600
达到0.6-0.8，随后在18℃、300rpm下，持续培养16-18小时。离心收集细胞，重悬于50mm ph 7.4的磷酸钠中，高压均质裂解。裂解液再次离心以收集可溶性粗裂解液。将可溶性组分与等体积的5m nacl混合，混合物上样到疏水柱中。上样后，用5倍柱体积的20mm磷酸钠(ph 7.4)、2.5m nacl洗涤柱子。然后用10mm磷酸钠(ph 7.4)洗脱重组嵌合裂解酶。
[0140]
实施例6
[0141]
最小抑菌浓度测定
[0142]
最小抑菌浓度(mic)测定方法如下。首先在0.9％生理盐水中制备菌落悬浮液至od
600
为0.05以制备接种物，相当于每毫升107菌落形成单位(cfu/ml)。悬浮液在无琼脂强化梭菌培养基(rcm)中稀释20倍至接种物为5*105cfu/ml。用0.9％的生理盐水制备2倍连续稀释的pacl10或万古霉素，并且加入不超过总培养物的十分之一。培养物在厌氧条件下于37℃培养3天。mic为肉眼观察不到痤疮丙酸杆菌的生长时的pacl10或万古霉素的最低浓度。通过将上述培养物在含有0.1％吐温-80的强化梭菌琼脂(rca)平板上传代培养来测定最小杀菌浓度(mbc)。mbc为在强化梭菌琼脂(rca)平板上未见痤疮丙酸杆菌菌落时的pacl10或万古霉素的最低浓度。
[0143]
实验结果：表6-1示出了pacl10与万古霉素相比，对来自ia1、ia2、ii进化枝的12株痤疮丙酸杆菌菌株的最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)。
[0144]
表6-1
[0145][0146]
实施例7
[0147]
时间杀菌试验
[0148]
时间杀菌试验方法如下。将痤疮丙酸杆菌34a菌株菌落重新悬浮于0.9％生理盐水中至od
600
为0.05，相当于107cfu/ml。悬浮液在50mm磷酸钠(ph 6.0)中稀释10倍至～106cfu/ml。34a菌株分别加入0、0.5x、1x、2x mic的两倍连续稀释的pacl10。在每个时间点将试验中的十倍系列稀释液(0,1,2,3log)铺板在强化梭菌琼脂(rca)上，并在厌氧条件下于37℃培养3天。实验结果见图4。
[0149]
实施例8
[0150]
单步纯化后所选裂解酶的最小抑菌浓度
[0151]
表达pacl 10、390、391、392、403和404参照实施例1～4的方法，并进行如下的单步纯化：将含有每种重组表达质粒的大肠杆菌bl21(de3)置于自诱导培养基中在37℃、300rpm下培养3h，随后在18℃、300rpm下培养16-18小时。离心收集细胞，高压均质裂解。来自1l表达目标蛋白的大肠杆菌培养基的澄清裂解液上样至含有70ml纯化树脂的26mm/200mm柱。根据表8-1中的条件纯化裂解酶，单步纯化后的裂解酶的纯度测定如图5所示。这些裂解酶用于测定最小抑菌浓度(mic)。
[0152]
最小抑菌浓度(mic)测定方法如下。痤疮丙酸杆菌在强化梭菌琼脂(具有1.5％琼脂的强化梭菌培养基rcm，根据修订后的配方配制rcm，每升-10g酸水解酪蛋白、10g牛肉提取物、3g酵母提取物、5gd-葡萄糖、5g氯化钠、3g醋酸钠、0.5g l-半胱氨酸盐酸盐)上划线。平板在37℃下厌氧培养72小时。首先在0.9％生理盐水中重悬来自rca的单克隆至od
600
为0.05以制备用于mic测定的接种物，相当于每毫升107菌落形成单位(cfu/ml)。悬浮液在rcm中稀释20倍至接种物为5*105cfu/ml。用0.9％的生理盐水制备2倍连续稀释的每种裂解酶，并且加入不超过总培养物体积的十分之一。培养物在厌氧条件下于37℃培养48-72小时。mic为肉眼观察不到痤疮丙酸杆菌的生长时的裂解酶的最低浓度。mic结果如表8-2所示。
[0153]
表8-1所选裂解酶的纯化条件
[0154][0155][0156]
表8-2所选裂解酶相对痤疮丙酸杆菌的mic(μg/ml)
[0157][0158]
实施例9
[0159]
pacl392的纯化和杀菌活性
[0160]
pacl392在含有重组表达质粒的大肠杆菌bl21(de3)中通过置于自诱导培养基中在37℃、300rpm下培养3h，随后18℃、300rpm培养16-18小时进行表达。离心收集细胞，在20mm、ph 7.4的磷酸钠中高压均质裂解。裂解液在12,000rpm、4℃下离心1h。将上清液与等体积的20mm、ph 7.4的磷酸钠、1m硫酸铵混合，在12,000rpm、4℃下再次离心1h。上清液用0.22μm滤膜过滤，上样到用20mm、ph 7.4的磷酸钠、0.5m硫酸铵平衡的混合模式色谱柱(70ml纯化树脂的26mm/200mm柱)。上样后，用一系列缓冲液洗涤柱：20mm、ph 7.4的磷酸钠，0.5m硫酸铵；20mm、ph 7.4的磷酸钠，2.5m nacl；20mm、ph 7.4的磷酸钠和50mm、ph 10.02的
哌嗪，50mm nacl。用50mm、ph 10.02的哌嗪和750mm nacl洗脱pacl392。洗脱液用50mm、ph 7.4的磷酸钠透析以中和ph并去除阳离子。透析样品过滤并上样到离子交换色谱柱(70ml纯化树脂的26mm/200mm柱)。pacl392纯化的最终结果如图6所示。
[0161]
pacl392的杀菌活性通过在一系列添加剂如nacl、cacl2、mgcl2、edta、dtt、吐温-20、吐温-80和透明质酸(浓度如图7所示)存在下的50mm、ph 7.0的hepes中的cfu减少来测定。
[0162]
实施例10
[0163]
pacl403的纯化和杀菌活性
[0164]
pacl403在含有重组表达质粒的大肠杆菌bl21(de3)中通过置于自诱导培养基中在37℃、300rpm下培养3h，随后18℃、300rpm培养16-18小时进行表达。离心收集细胞，在20mm、ph 7.4的磷酸钠中高压均质裂解。将裂解物溶液调节至20mm、ph 7.4的磷酸钠、1m nacl，并在12,000rpm、4℃下离心1h。上清液用0.22μm滤膜过滤，上样到用20mm、ph 7.4的磷酸钠、1m nacl平衡的混合模式色谱柱(70ml纯化树脂的26mm/200mm柱)。上样后，用一系列缓冲液洗涤柱：20mm、ph 7.4的磷酸钠，1m nacl；20mm、ph 7.4的磷酸钠，2.5m nacl；20mm、ph 7.4的磷酸钠；20mm、ph 7.4的磷酸钠，0.1％triton x-114和再次加入20mm、ph 7.4的磷酸钠。用50mm、ph 9.5的哌嗪、1m nacl洗脱pacl403。通过加入五分之一体积的500mm、ph 7.4的磷酸钠来中和高ph。然后将洗脱液用50mm、ph 7.4的磷酸钠透析以去除阳离子。透析样品过滤。pacl403纯化的最终结果如图8所示。
[0165]
pacl403的杀菌活性通过在如图9所示浓度的吐温-20和吐温-80存在下的50mm、ph 7.0的磷酸钠中的od减少来测定。
[0166]
pacl403的杀菌活性通过在如图10所示浓度的吐温-20和吐温-80存在下的50mm、ph 7.0的hepes中的cfu减少来测定。
[0167]
pacl403还能杀死生物膜相关的痤疮丙酸杆菌(图11)。将od
600
为1.0的菌株10加入96孔聚苯乙烯平板，以在厌氧气体混合物中过夜接种生物膜。去除上清液，孔用0.9％nacl轻轻冲洗。加入生物膜形成培养基(rcm+5％葡萄糖)，以使生物膜在厌氧气体混合物中过夜生长。去除培养基，孔用0.9％nacl轻轻冲洗。然后用缓冲液或pacl403在25℃、厌氧下过夜处理生物膜。去除缓冲液或pacl403，孔用0.9％nacl冲洗。重悬于0.9％nacl中，在rcm琼脂上铺板，对生物膜相关的cfu进行计数。