一株产乳酸凝结芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于生物工程技术领域，提供了一株产乳酸凝结芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)是一类可以形成芽孢同时又产乳酸的细菌，被美国食品与药物管理局(fda)和美国饲料控制官员协会列入可用于饲料的安全微生物菌种名单。凝结芽孢杆菌作为一种新型微生态制剂，能产乳酸，具有调控动物肠道健康等多种生物学功能，主要体现在调节肠道功能紊乱、维持肠道菌群平衡、改善肠道形态结构、增强机体免疫能力、促进营养物质吸收代谢以及提高生产性能等方面，同时由于其能产生芽孢，具有抗逆性强、抗胃酸、抗干燥、耐高温高压和易贮存等独特的生物特性，其广泛分布于土壤、植物根际、动物粪便和许多人类食品中。
3.如何获取高活性高浓度的芽孢是制约凝结芽孢杆菌制剂生产的关键因素，凝结芽孢杆菌的发酵配方优化也显得尤为重要。目前，有不少有关凝结芽孢杆菌发酵配方的优化，但发酵水平整体不高，且多数集中在液体摇瓶发酵及固体发酵水平上，如专利cn109207406a所公布的凝结芽孢杆菌液体摇瓶发酵水平在50*108cfu/ml,专利cn101412983虽然使用发酵罐发酵，但其发酵水平仅在1.0*109cfu/ml。
4.发酵饲料主要通过微生物的生长代谢作用或生产代谢过程产生的一些活性物质作用于发酵底料，将其中的大分子物质或抗营养因子分解为更易于动物体吸收的小分子物质提高饲料的利用率，同时发酵饲料中富含的微生物进入动物肠道后能够增加肠道有益菌群数量，抑制或降低病原菌数量，从而提高肠道健康。酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌为最常见的可饲用益生菌，广泛用于发酵饲料，亦有一些发酵饲料制备的文献资料，但是总体来看，存在发酵水平低，效果不明显，保存期短的问题。同样，在水产菌剂上，也面临着相似的行业问题。
5.因此，能否获得更适用于实际生产的产乳酸凝结芽孢杆菌成为研究人员的重要任务之一。


技术实现要素：

6.本发明针对上述技术存在的不足，提供了一株产乳酸凝结芽孢杆菌，该菌株经过16srdna鉴定为凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)，发明人将该菌株进行了生物保藏，其保藏编号为cgmcc no.22760，该菌株具有较高的稳定性及耐受性，能够耐高温、耐胃酸、耐胆盐；经发酵配方优化，液体发酵芽孢量可高达98.8
×
108cfu/ml，芽孢率93.4％；将该菌剂与em菌复配应用于水产养殖，能明显增加虾的体重，改善水质指标，增加水体中溶解氧，降低氨氮、亚硝酸盐；将该菌剂与屎肠球菌、酵母复配发酵饲料，发酵后总菌量可达到208.0*108cfu/g，相比于单纯的屎肠球菌与酵母复配发酵总菌量提高133.2％，且该菌剂混合发酵饲料密封存放90d后菌量仍可保持在90％以上，明显延长储存周期。另外，用上述混合发酵饲料饲喂育肥猪后，经检猪测粪便中总菌量明显提高，大肠杆菌数明显降低，腹泻率降低，
料肉比减低，日增重提高，从而提高了猪肉品质，增加了产量，降低了成本。可广泛应用于水产养殖与发酵饲料领域的产品开发。
7.本发明提供的具体技术方案是：
8.本发明获得了一株新的产乳酸凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)，其生物保藏编号为cgmcc no.22760，命名为yjy21-05，其具体获得方法如下：
9.该菌株是发明人从山东滨州某养殖厂健康仔猪粪便中取样，经选择性培养基筛选出一株具有良好抑菌效果及传代特性的产酸芽孢杆菌，将其命名为yjy21-05，该菌株为征革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，端生芽孢，无鞭毛；该菌株在ypd平板上呈现乳白色、不透明圆形菌落，表面湿润、平坦、边缘整齐，ypd液体培养最适温度为45℃。
10.发明人对其进行了16srdna测序，其核苷酸序列如seq id no:1所示，该序列为菌株的16srdna的全序列；所测得的16srdna序列进行blast比对，比对结果显示，该菌株的16srdna的核苷酸序列与凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)的菌株有100％的同源性。
11.因此发明人将其菌株代码命名为yjy21-05；并对其进行了生物保藏，其生物保藏编号为cgmcc no.22760。
12.发明人进一步进行了菌株的生理特性实验如下：
13.①
温度实验
14.分别验证了该菌株在一种基本培养基下30、35、40、45、50℃的生长状况，由图2可知，45℃芽孢量最高，为其最适宜温度，且50℃高温仍可生长，具有一定的耐热性。
15.②
抑制病原菌实验
16.对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气荚膜梭菌、猪霍乱沙门氏菌4株病原指示菌进行抑菌圈实验，均有抑菌圈产生，说明本发明所提供的凝结芽孢杆菌株对4株病原指示菌均有不同程度的抑制作用。
17.③
耐胃酸实验
18.模拟人工胃液，通过盐酸调节不同的ph值，将培养好的菌液离心，收集芽孢后加入到无菌人工胃液，37℃，处理2h，结果如表1所示，由结果可知，该菌株可耐受ph在2.5-3.5之间的胃液，模拟人工胃液处理120min后，凝结芽孢杆菌存活率大于97.2％。
19.表1凝结芽孢杆菌耐胃酸实验
[0020][0021]
④
耐胆盐实验
[0022]
配制人工肠液，分别加入质量分数分别为0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、2.0％的胆盐，无菌情况下取1ml菌液加入9ml不同胆盐浓度的培养液中，30℃静置培养6h后检测活菌量，结果如表2所示，由结果可知，凝结芽孢杆菌可耐受0.5％以内的胆盐，其存活率可达到
89.2％以上，说明小肠中的胆盐对凝结芽孢杆菌菌体生长无影响。
[0023]
表2凝结要杆菌耐胆盐实验
[0024][0025]
获得上述菌株后，发明人还提供了对应的液体发酵生产方法如下：
[0026]
500l发酵罐制备液体菌剂发酵工艺：
[0027]
(1)菌种活化：将保存在4℃冰箱中的菌种取出，于室温条件下活化3-4h，由于菌种保藏与试管斜面ypd培养基上，活化过程无需额外补加营养。
[0028]
(2)种子制备工艺：在灭菌的无菌台中，取10ml灭菌的蒸馏水加入已活化试管中，反复吹打制成菌悬液，然后将菌悬液接入100ml的无菌的ypd液体培养基中，震荡培养16-18h完成一级种子的制备；
[0029]
然后将培养成熟的一级种子转接二级种子，将一级种子接入到950mlypd液体培养基，接种量为10％(体积比)，培养16-18h完成二级种子的制备；再以10％(体积比)的接种量将二级种子接入50l种子罐，种子罐有效体积30l采用的培养基为ypd液体培养基，ph自然，生长周期为5-6h，即可作为三级种子；
[0030]
(3)菌剂发酵工艺：
[0031]
将上述三级种子转入500l发酵罐，有效体积为300l，接种量10％(体积比)，
[0032]
发酵罐中的培养基配方按重量分数计为：可溶性淀粉2.0-4.0％，麦芽糖1.0-2.0％，麸皮1.0-3.0％，氯化铵1.0-3.0％，鱼粉1.0-2.0％，豆粕1.0-2.0％，磷酸氢二钾0.2-0.6％，硫酸镁0.01-0.05％，氯化钙0.1-0.4％，硫酸亚铁0.003-0.007％，氯化钠0.2-0.6％，硫酸锰0.01-0.05％，烟酸0.01-0.03％，vb10.01-0.04％，聚醚消泡剂0.10-0.15％，余量为水；
[0033]
发酵条件如下：
[0034]
温度45℃，灭菌前初始ph7.5，发酵过程随着菌种的生长，ph出现波动，发酵过程用20wt％氢氧化钠溶液或10wt％硫酸溶液调节ph，使ph维持在6.5，发酵罐接种量在10％，初始通风比1：1(v:v)，最高通风比1：1.5(v:v)，搅拌转速100r/min，最高300r/min，发酵过程前期溶氧控制在20-25％，发酵周期在25-30h即可获得目标菌剂；其中，实验过程中500l发酵罐发酵优选30h结束，检测芽孢量可达98.8
×
108cfu/ml，芽孢率可达93.4％。附图1为500l发酵罐生长曲线。
[0035]
发明人上述制备的菌剂用于南美白对虾养殖，具体方法如下：
[0036]
进行南美对虾为期30d的跟踪养殖实验，设置四个虾塘进行，虾塘面积均为7.5亩，水深均为2米，对照组不添加该菌剂及em菌剂，实验组1为仅添加市购em菌剂，实验组2为仅添加本技术上述获得的凝结芽孢杆菌菌剂，实验组3为添加市售em菌及上述获得的凝结芽孢杆菌菌剂的混合菌剂，每个虾塘每次施用总菌剂量均为15l，实验组3中两者按重量比1：1
混合，分别于第1d和第15d进行2次均匀泼洒菌剂。
[0037]
30d后，检测水质指标及虾增重指标如表3所示。由结果可知，本发明获得的菌剂和em菌剂复配后施用，效果最佳，相比于不施用或单独施用一种菌剂有更为明显的效果。复配施用后能明显改善水质指标，增加水体中溶解氧，降低氨氮、亚硝酸盐，实验组3对虾体重由22.0g/尾增加至44.5g/尾，体重增加102.3％，相比于对照组(体重增加72.7％)多增加29.6个百分点。
[0038]
表3施用菌剂30d后水质及虾增重结果
[0039][0040]
利用上述菌剂复配获得发酵饲料：
[0041]
发明人通过上述制备的菌剂与屎肠球菌(cicc 20433)液体菌剂，酵母菌(cicc 32637)液体菌剂以6：2：2(菌剂发酵液体积比)的比例复配发酵饲料作为实验组，对照组为屎肠球菌液体菌剂及酵母菌液体菌剂按1：1(菌剂发酵液体积比)的比例复配。其中，屎肠球菌液体菌剂及酵母菌液体培养基分别为mrs培养基及ypd培养基，培养温度分别为35℃及30℃，分别采用常规的厌氧发酵及好氧发酵技术培养，培养时间均为20h。
[0042]
实验组及对照组均以6.0％的接种量将上述菌剂添加至发酵饲料进行厌氧发酵。发酵饲料底料为：玉米粉：麸皮：豆粕重量比为4：3：3，控制水分在30％。35℃，发酵72h，结果如表4所示：采用含有本发明菌剂的实验组发酵料中的乳酸、游离氨基酸、干物质回收率、粗蛋白含量均有不同程度的增加，发酵后总菌量可达到208.0*108cfu/g，相比于单纯的屎肠球菌与酵母复配发酵提高菌量133.2％，密封存放90d后菌量仍可保持在90％以上，明显高于原发酵工艺，延长储存周期。
[0043]
表4菌株复配发酵饲料结果检测
[0044][0045][0046]
发明人将上述制备的发酵饲料用于育肥猪的饲喂，具体方法如下：
[0047]
分别用上述对照组与实验组制备的发酵饲料进行一组育肥猪为期60d的饲喂跟踪，按照正常发酵饲料的饲喂量进行实验，其他均按照常规饲喂规则进行，结果如表5所示，饲喂实验组发酵饲料的育肥猪粪便中的总菌量明显提高，大肠杆菌数明显降低，腹泻率降
低，60d后计算猪料肉比减低10.5％，日增重提高15.2％，由此可知，饲喂含该菌株的发酵料能明显改善育肥猪的肠道环境，防控疾病促进生长，从而提高品质，降低成本。
[0048]
表5发酵饲料饲喂实验跟踪数据
[0049][0050]
综上所述，该菌株具有较高的稳定性及耐受性，能够耐高温、耐胃酸、耐胆盐；经发酵配方优化，液体发酵芽孢量可高达98.8
×
108cfu/ml，芽孢率93.4％；将该菌剂与em菌复配应用于水产养殖，能明显增加虾的体重，改善水质指标，增加水体中溶解氧，降低氨氮、亚硝酸盐；将该菌剂与屎肠球菌、酵母复配发酵饲料，发酵后总菌量可达到208.0*108cfu/g，相比于单纯的屎肠球菌与酵母复配发酵总菌量提高133.2％，且该菌剂混合发酵饲料密封存放90d后菌量仍可保持在90％以上，明显延长储存周期。另外，用上述混合发酵饲料饲喂育肥猪后，经检猪测粪便中总菌量明显提高，大肠杆菌数明显降低，腹泻率降低，料肉比减低，日增重提高，从而提高了猪肉品质，增加了产量，降低了成本。可广泛应用于水产养殖与发酵饲料领域的产品开发。
[0051]
保藏信息，
[0052]
保藏时间：2021年06月23日
[0053]
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心
[0054]
保藏编号：cgmcc no.22760
[0055]
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所
[0056]
分类命名:凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)
附图说明
[0057]
图1为本发明所述产乳酸凝结芽孢杆菌在500l发酵罐中的生长曲线；
[0058]
图2为本发明所述产乳酸凝结芽孢杆菌在不同温度下培养芽孢量的曲线。
具体实施方式
[0059]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成下述实施例中所采用的菌种均为保藏号cgmcc no.22760的菌种。
[0060]
实施例1产乳酸凝结芽孢杆菌的获取及其生理特性
[0061]
本发明获得了一株新的产乳酸凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)，其生物保藏编号为cgmcc no.22760，命名为yjy21-05，其具体获得方法如下：
[0062]
该菌株是发明人从山东滨州某养殖厂健康仔猪粪便中取样，经选择性培养基筛选出一株具有良好抑菌效果及传代特性的产酸芽孢杆菌，将其命名为yjy21-05，该菌株为征
革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，端生芽孢，无鞭毛；该菌株在ypd平板上呈现乳白色、不透明圆形菌落，表面湿润、平坦、边缘整齐，ypd液体培养最适温度为45℃。
[0063]
发明人对其进行了16srdna测序，其核苷酸序列如seq id no:1所示，该序列为菌株的16srdna的全序列；所测得的16srdna序列进行blast比对，比对结果显示，该菌株的16srdna的核苷酸序列与凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)不同菌株的核苷酸序列有大于99％的同源性，与其中明确标记为凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)的菌株有100％的同源性。
[0064]
因此发明人将其菌株代码命名为yjy21-05；并对其进行了生物保藏，其生物保藏编号为cgmcc no.22760。
[0065]
发明人进一步进行了菌株的生理特性实验如下：
[0066]
①
温度实验
[0067]
分别验证了该菌株在一种基本培养基下30、35、40、45、50℃的生长状况，由图2可知，45℃芽孢量最高，为其最适宜温度，且50℃高温仍可生长，具有一定的耐热性。
[0068]
②
抑制病原菌实验
[0069]
对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气荚膜梭菌、猪霍乱沙门氏菌4株病原指示菌进行抑菌圈实验，均有抑菌圈产生，说明本发明所提供的凝结芽孢杆菌株对4株病原指示菌均有不同程度的抑制作用。
[0070]
③
耐胃酸实验
[0071]
模拟人工胃液，通过盐酸调节不同的ph值，将培养好的菌液离心，收集芽孢后加入到无菌人工胃液，37℃，处理2h，结果如表1所示，由结果可知，该菌株可耐受ph在2.5-3.5之间的胃液，模拟人工胃液处理120min后，凝结芽孢杆菌存活率大于97.2％。
[0072]
表1凝结芽孢杆菌耐胃酸实验
[0073][0074]
④
耐胆盐实验
[0075]
配制人工肠液，分别加入质量分数分别为0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、2.0％的胆盐，无菌情况下取1ml菌液加入9ml不同胆盐浓度的培养液中，30℃静置培养6h后检测活菌量，结果如表2所示，由结果可知，凝结芽孢杆菌可耐受0.5％以内的胆盐，其存活率可达到89.2％以上，说明小肠中的胆盐对凝结芽孢杆菌菌体生长无影响。
[0076]
表2凝结要杆菌耐胆盐实验
[0077][0078]
实施例2 500l发酵罐制备液体菌剂发酵工艺
[0079]
(1)菌种活化：将保存在4℃冰箱中的菌种取出，于室温条件下活化3h，由于菌种保藏与试管斜面ypd培养基上，活化过程无需额外补加营养。
[0080]
(2)种子制备工艺：在灭菌的无菌台中，取10ml灭菌的蒸馏水加入已活化试管中，反复吹打制成菌悬液，然后将菌悬液接入100ml无菌的ypd液体培养基中，震荡培养18h完成一级种子的制备；然后将培养成熟的一级种子转接二级种子，二级种子为950mlypd液体培养基，接种量为10％(体积比)，培养16h完成二级种子的制备；再以10％(体积比)的接种量将二级种子接入50l种子罐，种子罐内含有ypd液体培养基30l，ph自然，生长周期为6h，即可作为三级种子；
[0081]
(3)菌剂发酵工艺：
[0082]
将上述三级种子转入500l发酵罐，有效体积为300l，接种量10％，发酵罐中的培养基配方按重量分数计为：可溶性淀粉3.0％，麦芽糖1.2％，麸皮1.2％，氯化铵2.0％，鱼粉1.5％，豆粕1.5％，磷酸氢二钾0.4％，硫酸镁0.04％，氯化钙0.2％，硫酸亚铁0.005％，氯化钠0.4％，硫酸锰0.04％，烟酸0.02％，vb1 0.02％，聚醚消泡剂0.15％，余量为水。
[0083]
发酵条件如下：温度45℃，灭菌前初始ph7.5，发酵过程随着菌种的生长，ph出现波动，发酵过程用20wt％氢氧化钠溶液或10wt％硫酸溶液调节ph，使维持ph在6.5，发酵罐接种量在10％(体积比)，初始通风比1：1(v:v)，最高通风比1：1.5(v:v)，搅拌转速100r/min，最高300r/min，发酵过程前期溶氧控制在20-25％，发酵周期在30h获得目标菌剂，芽孢量可达98.8
×
108cfu/ml，芽孢率可达93.4％。
[0084]
实施例3菌株的应用一
[0085]
发明人将实施例2中制备的菌剂用于南美白对虾养殖，具体方法如下：
[0086]
进行南美对虾为期30d的跟踪养殖实验，设置四个虾塘进行，虾塘面积均为7.5亩，水深均为2米，对照组不添加该菌剂及em菌剂，实验组1为仅添加市购em菌剂，实验组2为仅添加本技术上述获得的凝结芽孢杆菌菌剂，实验组3为添加市售em菌及上述获得的凝结芽孢杆菌菌剂的混合菌剂，每个虾塘每次施用总菌剂量均为15l，实验组3中两者按重量比1：1混合，分别于第1d和第15d进行2次均匀泼洒菌剂。
[0087]
30d后，检测水质指标及虾增重指标如表3所示。由结果可知，本发明获得的菌剂和em菌剂复配后施用，效果最佳，相比于不施用或单独施用一种菌剂有更为明显的效果。复配施用后能明显改善水质指标，增加水体中溶解氧，降低氨氮、亚硝酸盐，实验组3对虾体重由22.0g/尾增加至44.5g/尾，体重增加102.3％，相比于对照组(体重增加72.7％)多增加29.6个百分点。
[0088]
表3施用菌剂30d后水质及虾增重结果
[0089][0090]
实施例4菌株的应用二
[0091]
利用实施例2中制备的菌剂获得发酵饲料：
[0092]
发明人通过上述制备的菌剂与屎肠球菌(cicc 20433)液体菌剂，酵母菌(cicc 32637)液体菌剂以6：2：2(菌剂发酵液体积比)的比例复配发酵饲料作为实验组，对照组为屎肠球菌液体菌剂及酵母菌液体菌剂按1：1(菌剂发酵液体积比)的比例复配。其中，屎肠球菌液体菌剂及酵母菌液体培养基分别为mrs培养基及ypd培养基，培养温度分别为35℃及30℃，分别采用常规的厌氧发酵及好氧发酵技术培养，培养时间均为20h。
[0093]
实验组及对照组均以6.0％的接种量将上述菌剂添加至发酵饲料进行厌氧发酵。发酵饲料底料为：玉米粉：麸皮：豆粕重量比为4：3：3，控制水分在30％。35℃，发酵72h，结果如表4所示：采用含有本发明菌剂的实验组发酵料中的乳酸、游离氨基酸、干物质回收率、粗蛋白含量均有不同程度的增加，发酵后总菌量可达到208.0*108cfu/g，相比于单纯的屎肠球菌与酵母复配发酵提高菌量133.2％，密封存放90d后菌量仍可保持在90％以上，明显高于原发酵工艺，延长储存周期。
[0094]
表4菌株复配发酵饲料结果检测
[0095][0096][0097]
发明人将上述制备的发酵饲料用于育肥猪的饲喂，具体方法如下：
[0098]
分别用上述对照组与实验组制备的发酵饲料进行一组育肥猪为期60d的饲喂跟踪，按照正常发酵饲料的饲喂量进行实验，其他均按照常规饲喂规则进行，结果如表5所示，饲喂实验组发酵饲料的育肥猪粪便中的总菌量明显提高，大肠杆菌数明显降低，腹泻率降低，60d后计算猪料肉比减低10.5％，日增重提高15.2％，由此可知，饲喂含该菌株的发酵料能明显改善育肥猪的肠道环境，防控疾病促进生长，从而提高品质，降低成本。
[0099]
表5发酵饲料饲喂实验跟踪数据
[0100][0101]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。