融合蛋白及其表达细胞株与应用的制作方法

1.本发明涉及生物免疫治疗技术领域，尤其涉及融合蛋白及其表达细胞株与应用。


背景技术：

2.自然杀伤(nk)细胞通过杀伤性免疫球蛋白样受体(kir)及共刺激受体依赖、主要组织相容性复合物(mhc)非依赖方式识别病变细胞，不需提前免疫致敏，可在几十分钟内杀伤恶性细胞，因而被认为是最有效的体内监视和清除病变细胞的免疫细胞亚群，在机体早期抗病毒的免疫应答中同样起到关键作用。在恶性血液性疾病如急性髓系白血病及肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、黑色素瘤等多种实体瘤中有着巨大的前景。
3.nk细胞具有如下特点:
①
强大的细胞毒活性。它对刺激因素产生的应答十分迅速，而且免疫应答强度高。
②
杀伤活性无需抗原刺激，也不受mhc分子的限制。病毒感染或恶性转化细胞的mhcⅰ类分子表达下降或消失，借这一机制逃避t细胞识别，但又能使nk细胞处于活化状态，从而与t细胞应答互为补充发挥免疫防御功能。
③
强大的细胞因子/趋化因子分泌功能，有助于启动和活化其他免疫细胞(如t细胞、b细胞、树突状细胞和内皮细胞等)的应答。因此，nk细胞在固有免疫和适应性免疫中均发挥重要作用。
4.目前体外激活扩增培养的nk细胞，一般纯度表型不稳定且纯度不高(纯因子培养不稳定，难保证效果)，并且，体外培养的nk细胞往往扩增倍数受限，细胞活性、杀伤活性也因此受到限制，培养时间长。现有技术中，常在nk细胞培养体系中添加细胞因子及饲养层细胞，以期提高nk细胞的体外培养效果，但效果仍非常有限。为此，本领域技术人员通过基因改造饲养层细胞来进一步提高nk细胞的培养效果，但截至目前为止，尚无法实现获得良好的增殖效果的前提下缩短培养周期。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供融合蛋白及其表达细胞株与应用，该融合蛋白表达于细胞膜表面，该细胞株用作nk细胞的饲养层细胞，能更好地促进nk细胞增殖。
6.本发明提供了一种融合蛋白，其包括il-15、il-18、il-21、il-2和4-1bbl。
7.本发明对融合蛋白中，片段的连接顺序不做限定。在一些实施例中，所述的融合蛋白由c端至n端依次连接有il-15、il-18、il-21、il-2和4-1bbl；相邻片段以p2a、t2a、f2a或e2a连接。
8.本发明所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
9.本发明实施例中，所述融合蛋白的c端还包括抗性蛋白片段。
10.一些实施例中，所述抗性蛋白为bsd抗性蛋白。
11.本发明还提供了编码所述融合蛋白的核酸。
12.本发明中，所述核酸的序列如seq id no:2所示。
13.本发明还提供了一种重组载体，其包括骨架载体和所述的核酸。
14.一些实施例中，所述骨架载体为慢病毒载体。
15.一些具体实施例中，所述慢病毒载体为pwpi载体。
16.本发明还提供了一种细胞株，其表达所述的融合蛋白。
17.本发明中，所述细胞株为表达所述的融合蛋白的人类体细胞或肿瘤细胞。
18.一些实施例中，所述人类体细胞为hek293ft细胞；所述肿瘤细胞为k562细胞。
19.本发明所述细胞株的构建方法，其包括：将本发明所述的重组载体，包装成为慢病毒后浸染细胞获得所述细胞株。
20.本发明还提供了一种膜蛋白复合物的制备方法，其包括：将本发明所述细胞株接种于含有人血白蛋白的培养基，经辐照、裂解、过滤，收集含有膜蛋白复合物的滤液。
21.本发明所述的制备方法中所述培养基为kbm581。
22.一些实施例中，所述培养基与人血白蛋白的体积比为1:1。
23.一些实施例中，所述细胞株的接种密度为1
×
108cells/ml。
24.一些实施例中，所述辐照的强度为100～150gy。
25.一些实施例中，所述裂解采用反复冻融法；所述过滤的滤网滤径为0.22μm。
26.本发明还提供了所述制备方法制得的膜蛋白复合物。
27.本发明所述的细胞株或所述的膜蛋白复合物，在nk细胞培养中的应用。
28.本发明还提供了一种nk细胞的培养基质，其包括：基础培养基、所述的膜蛋白复合物、干细胞培养上清液。
29.本发明中，所述基础培养基、膜蛋白复合物和干细胞培养上清液的体积比为1000:5:100。
30.本发明中，所述基础培养基为kbm581，所述干细胞培养上清液为脂肪干细胞的培养上清液。
31.本发明还提供了一种nk细胞的培养方法，其将nk细胞接种于培养基a，培养4d后，每48h补充新鲜的培养基质b；
32.所述培养基a为本发明所述的培养基质；
33.所述培养基b为本发明所述的培养基质。
34.本发明通过基因工程改造将融合蛋白(il-15、il-18、l-21、il-2和4-1bbl)表达在饲养层细胞表面，再裂解细胞形成抗原复合物，共培养可加强该蛋白对nk细胞的激活扩增效果。实验表明，无论是来源异体(异体外周血/脐血)或自体血，采用本发明方案均能稳定刺激扩增出高纯度高杀伤活性的nk细胞，通过体外采集分离，刺激扩增培养后nk细胞(cd3-cd16+cd56+、nkg2d)平均能达到纯度90％以上，活化受体大幅度上升，nk细胞扩增倍数数千倍，杀伤活性高。
附图说明
35.图1示融合蛋白表达载体图谱；
36.图2示实验组a培养nk细胞的流式检测图；
37.图3示实验组b培养nk细胞的流式检测图；
38.图4示实验组c培养nk细胞的流式检测图；
39.图5示显微镜下实验组a的nk细胞形态，放大40倍；
40.图6示显微镜下实验组a的nk细胞形态，放大400倍；
41.图7示各组nk细胞对四种癌细胞的杀伤率；
42.图8示nk细胞活化受体百分比。
具体实施方式
43.本发明提供了融合蛋白及其表达细胞株与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
44.本发明所述融合蛋白由il-15、il-18、il-21、il-2和4-1bbl融合而成，相对于其他蛋白融合形成的片段，表达本发明所述融合蛋白的细胞株作为滋养层细胞能够更有效的促进nk细胞的扩增。其中：
45.il-15是一种可溶性细胞因子，作为多种免疫细胞的趋化因子参与并调节机体炎症反应及免疫反应。本发明中，所述融合蛋白中il-15片段的氨基酸序为mriskphlrsisiqcylclllnshflteagihvfilgcfsaglpkteanwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints。
46.il-18属于il-1超家族，主要由巨噬细胞产生，但也由其他细胞类型产生，刺激各种细胞类型并具有多效性功能。本发明中，所述融合蛋白中il-18片段的氨基酸序列为maaepvedncinfvamkfidntlyfiaeddenlesdyfgklesklsvirnlndqvlfidqgnrplfedmtdsdcrdnaprtifiismykdsqprgmavtisvkcekistlscenkiisfkemnppdnikdtksdiiffqrsvpghdnkmqfesssyegyflacekerdlfklilkkedelgdrsimftvqned。
47.il-21主要由cd4+t细胞的th17亚群细胞和nkt细胞产生，与其受体结合后可促进nk细胞的增殖分化并提高nk细胞的杀伤活性本发明中，所述融合蛋白中il-21片段的氨基酸序列为mrsspgnmeriviclmviflgtlvhksssqgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgseds。
48.il-2可促进nk细胞增殖，维持nk细胞长期生长，在体外，短时间内可使nk细胞活性增强。促进nk细胞分泌ifn-γ，增加其表达il-2r+亚基等。本发明中，所述融合蛋白中il-2片段的氨基酸序列为myrmqllscialslalvtnsaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt*。
49.4-1bbl也叫cd137，和ox40同属肿瘤坏死因子(tnf)受体家族的成员，由肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9)基因编码。本发明中，所述融合蛋白中4-1bbl片段的氨基酸序列为meyasdasldpeapwppapraracrvlpwalvaglllllllaaacavflacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse。
50.本发明所述融合蛋白对il-15、il-18、il-21、il-2和4-1bbl的融合顺序不做限定，
所述融合蛋白的融合顺序对nk细胞的培养效果不产生影响。本发明实施例中，所述的融合蛋白由c端至n端依次连接有il-15、il-18、il-21、il-2和4-1bbl；相邻片段以p2a/t2a/f2a/e2a连接，具体的，所述融合蛋白的氨基酸序列为mriskphlrsisiqcylclllnshflteagihvfilgcfsaglpkteanwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfintsgsgegrgslltcgdveenpgpmrsspgnmeriviclmviflgtlvhksssqgqdrhmirmrqlidivdqlknyvndlvpeflpapedvetncewsafscfqkaqlksantgnneriinvsikklkrkppstnagrrqkhrltcpscdsyekkppkeflerfksllqkmihqhlssrthgsedsgsgatnfsllkqagdveenpgpmaaepvedncinfvamkfidntlyfiaeddenlesdyfgklesklsvirnlndqvlfidqgnrplfedmtdsdcrdnaprtifiismykdsqprgmavtisvkcekistlscenkiisfkemnppdnikdtksdiiffqrsvpghdnkmqfesssyegyflacekerdlfklilkkedelgdrsimftvqnedgsgvkqtlnfdllklagdvesnpgpmeyasdasldpeapwppapraracrvlpwalvaglllllllaaacavflacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprsegsgqctnyallklagdvesnpgpmyrmqllscialslalvtnsaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt*(seq id no:1)。
51.本发明还包括了含有融合蛋白编码核酸的转录单元，所述转录单元中包括启动子、编码融合蛋白的核酸和调控元件。所述启动子为cmv启动子，所述调控元件包括kozak和wpre。具体的，所述转录单元依次包括cmv启动子、kozak、编码融合蛋白的核酸和wpre。相对于其他启动子，cmv启动子更有利于核酸片段的表达，调控元件进一步提高了表达的水平。其中，编码seq id no:1所示氨基酸序列的核酸的序列为atgagaatttcgaaaccacatttgagaagtatttccatccagtgctacttgtgtttacttctaaacagtcattttctaactgaagctggcattcatgtcttcattttgggctgtttcagtgcagggcttcctaaaacagaagccaactgggtgaatgtaataagtgatttgaaaaaaattgaagatcttattcaatctatgcatattgatgctactttatatacggaaagtgatgttcaccccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcacttgagtccggagatgcaagtattcatgatacagtagaaaatctgatcatcctagcaaacaacagtttgtcttctaatgggaatgtaacagaatctggatgcaaagaatgtgaggaactggaggaaaaaaatattaaagaatttttgcagagttttgtacatattgtccaaatgttcatcaacacttctggaagcggagagggcaggggaagtcttctaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggccccatgagatccagtcctggcaacatggagaggattgtcatctgtctgatggtcatcttcttggggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaacttatagatattgttgatcagctgaaaaattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgctttcagaaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagactaacatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaagattccggaagcggagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcctatggctgctgaaccagtagaagacaattgcatcaactttgtggcaatgaaatttattgacaatacgctttactttatagctgaagatgatgaaaacctggaatcagattactttggcaagcttgaatctaaattatcagtcataagaaatttgaatgaccaagttctcttcattgaccaaggaaatcggcctctatttgaagatatgactgattctgac
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52.本发明所述融合蛋白的c端包括用作筛选标记的抗性蛋白。一些实施例中，所述抗性蛋白为bsd。bsd抗性蛋白由mpgk启动子启动表达。
53.本发明提供的融合蛋白表达于饲养细胞的表面，该饲养细胞无论是用于来源异体(异体外周血/脐血)或自体血，均能稳定刺激扩增出高纯度高杀伤活性的nk细胞，通过体外采集分离，刺激扩增培养后nk细胞(cd3-cd16+cd56+、nkg2d)平均能达到纯度90％以上，活化受体大幅度上升，nk细胞扩增倍数数千倍，杀伤活性高；并且，本发明应用脂肪干细胞上清液充当生长因子成分来源，提高细胞增殖活性；不用额外添加细胞因子，降低生产成本及污染风险；扩增的数量倍数高且稳定，优于纯因子培养的稳定性；二次处理分离的纯度较高脐血单个核，减少了杂细胞对后续培养的影响；并且，本发明无需提前包被抗体，节省时间，提高效率；大大缩短了常规培养时间，提高效率；此外，本发明中ge-k562经过辐照及裂解操作形成膜蛋白复合物，无残留风险；本发明的培养方法步骤简单，减少出错概率和操作污染。
54.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
55.实施例1
56.一、通过慢病毒转染构建目的蛋白过表达细胞株，p2a/t2a/f2a/e2a连接各基因使
目的蛋白il-15/il-18/il-21/il-2/4-1bbl均表达于细胞膜表面：
57.1、载体构建
58.①
人工合成编码bsd抗性/il-15//il-18/il-21/il-2/4-1bbl的dna片段，序列如seq id no:1所示。
59.②
使用dna连接酶分别将bsd/il-15/il-18/il-21/il-2/4-1bbl的pcr产物分别插入酶切后载体pwpi中(图1)。
60.2、转化
61.将重组载体转化入甘油菌，阳性菌落经扩培后，提取质粒dna，经酶切鉴定，收集阳性菌株。具体包括：取10μl小提质粒dna溶液，加入2μlpmel酶、3μl 10
×
cut smart buffer,用ddh2o补充至总体系30μl，于37℃下放置2h，将样品电泳并将凝胶置于bio-rad凝胶成像仪上进行成像。
62.将鉴定成功的载体进行甘油保菌；将高压灭菌后的甘油与700-800μl细菌溶液混合，使甘油的最终浓度为20％，并将细菌保存在-80℃。
63.3、大量抽提慢病毒相关载体，于293ft细胞中进行包装
64.3.1hek293ft细胞培养
65.①
从液氮保存罐中取出冻存的293ft细胞，在37℃水浴锅中水浴，快速融化；
66.②
将冻存悬液转移至安全柜的离心管中，加5ml完全培养基，1000rpm/min,5min,弃上清；
67.③
吸收完全培养基1ml重悬沉淀；
68.④
加5ml完全培养基到25cm2细胞培养瓶中，加1ml细胞悬液，标记瓶子记录后置于培养箱培养；
69.⑤
定期观察细胞操作处理、传代、冻存。
70.3.2抽提步骤2中保存的细菌中的重组载体，然后转染hek293ft细胞。
71.3.3表达融合蛋白的k562细胞系构建
72.①
k562细胞按规范复苏、传代、冻存；
73.②
步骤3.2包装获得的慢病毒感染k562细胞
74.③
k562稳转表达细胞系的筛选，并以流式细胞仪检测、验证，获得稳定表达融合蛋白的k562细胞
75.④
将筛选出的阳性细胞，扩大培养，建立k562细胞系
76.4、膜蛋白复合物制备
77.把步骤3制备获得的表达融合蛋白的k562细胞按1
×
108cells/ml的密度接种至培养物(用kbm581培养基：人血白蛋白＝1:1)混匀分装至5ml冻存管中进行100～150gy辐照；然后将经辐照的细胞冻存管在-196℃液氮及37℃水浴锅各15min反复冻融三次裂解，过滤0.22μm过滤网，取样计数观察已无活细胞，收集滤液为膜蛋白复合物，分装至5ml冻存管中，备用。
78.二、脂肪干细胞上清液制备
79.(1)制备前准备：恒温振荡器预热至37℃，超净台提前消毒，并摆放上离心管、移液管、75ml培养瓶、100μl细胞筛网、40μl细胞筛网，配置完全培养基(dmem-l+10％fbs)，胶原酶i工作液。
80.(2)接收脂肪组织：用75％的医用乙醇擦拭装脂肪组织的容器外壁。
81.(3)分装脂肪组织：吸取下层液体废弃，得到的脂肪组织分装到175ml培养瓶中，每瓶50ml。
82.(4)洗涤脂肪组织，去除血细胞：向t175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5分钟，分层后，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层水相较为清澈。
83.(5)胶原酶i消化：加入等量新配制的预热(提前半小时于37℃的气浴摇床预热)的胶原酶i溶液，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5-10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60min，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5-10秒，直到观察脂肪组织较为平滑即可。
84.(6)分离基质血管组分：将消化后的组织用40μm细胞筛网过滤，然后分装到50ml的离心管中，室温离心，400g，10min，得到的沉淀即为svf。
85.(7)洗涤细胞沉淀：得到上述沉淀后，移液管轻轻吸取上清脂肪油脂和胶原酶溶液。适量盐水重悬，400g、10min，离心完毕后，吸取上清做无菌检测。每管10ml培养基重悬，混合到一管内，100μl筛网过滤，再次室温离心300g，10min。
86.(8)种瓶：离心后加20ml培养基充分混匀。按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个t75培养瓶中接种10ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪组织，可以接种10个t75培养瓶。标识清楚后将上述细胞瓶平放于37℃、5％co2饱和湿度培养箱内。
87.(9)换液：隔天观察细胞贴壁情况，一周左右换液，将t75内上清废弃，重新加入干细胞完全培养基30ml/瓶。
88.(10)收集传代：三天后观察细胞生长情况，若长满瓶底则消化传代，收集细胞上清液于收集瓶中，用40μm细胞筛过滤，备用。
89.三、脐血单个核细胞制备
90.(1)将50ml注射器中的血转移到离心管中；离心分离出血浆，800g，10min，室温，升速9，降速3。离心完毕后分层，吸取上层血浆层到离心管中，贴上血浆编码标记，用封口膜缠绕密封，置于56℃水浴锅中灭活30min，取出后于4℃冰箱保存待用。
91.(2)铺层加样：将样本缓慢匀速的加入到盛有室温的淋巴细胞分离液上方，两者比例约为1:2，铺层的整个过程都应注意不能打破淋巴分离液与样本的分界面。离心：800g，20min，室温，升速3，降速3。
92.(3)提取单个核细胞:离心完毕后，离心管内出现明显分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、ficoll层、单个核细胞层、血浆生理盐水层。吸取血浆生理盐水层弃之，直至距白膜层5mm处，小心将红细胞层之上的白膜层转移至50ml离心管中，补充生理盐水，细胞悬液与生理盐水比例大于1:3，混匀。
93.(4)离心：800g，10min，室温，升速3，降速3。
94.(5)离心完毕后弃掉上清液，用40ml生理盐水重悬细胞沉淀，混匀，取0.5ml混匀悬液计数，取5ml混悬液送检。
95.(6)离心：600g，10min，室温，升速9，降速9。
96.(7)弃掉上清液，获得初步纯化的cbmc。
97.(8)磁珠分选：用少量孵育液充分混匀细胞，加入一抗(10-20μg/ml终浓度)，4℃孵育30min；用20倍体积pbe洗涤细胞，再加pbe充分混匀细胞后，加入相应二抗包被的超微磁
珠，混匀后静置于8-15℃10-15min；将分离柱安装入磁场中，加入0.5mlpbe，在重力作用下自然流尽。以0.5ml的pbe加到分离柱中，自然流尽，洗柱两次；从磁场中取下分离柱，插在试管口，加1-2ml的pbe，用针芯推尽液体，冲出阳性结合的细胞，用培养基洗涤一次；于细胞沉淀中加入2～3mlkbm581培养基，用1ml移液枪轻轻、反复吹吸细胞，充分混匀；并取样细胞计数，量取细胞体积，计算细胞密度，总数与活率。
98.四nk细胞培养
99.以实施例1制备获得的原料，培养nk细胞，共进行三个平行，记做实验组a、实验组b和实验组c：
100.1、培养基配制：
101.培养基：每1000mlkbm581培养基+5ml实施例1制备的膜蛋白复合物+100ml步骤2制备的干细胞上清液。
102.2、nk细胞培养
103.起始培养：将nk细胞接种于培养基，在t-75培养瓶中混合，置于37℃，5％co2培养箱中培养，接种密度为1.0
×
106cells/ml。
104.补液：培养过程中补加培养基，维持密度1.0
×
106cells/ml。
105.第4-7每天观察细胞，根据细胞悬液颜色或细胞量添加培养液(培养基变橙黄色、补充不超过一倍体积的培养基)。第8天收集细胞。
106.对比例1
107.1、培养基配制：
108.培养基：每1000mlkbm581培养基+500iu/ml的il-2+100ml实施例2制备的干细胞上清液。
109.2、nk细胞培养步骤参数与实施例4一致。
110.对比例2
111.1、培养基配制：
112.培养基：每1000ml kbm581培养基+1μg/ml cd3单抗+5μg/mlil-15+5.0μg/ml il-18。
113.2、nk细胞培养步骤参数与实施例4一致。
114.对比例3
115.1、培养基配制：
116.培养基：每1000ml kbm581培养基+0.1μg/ml cd3单抗、1.0μg/mlcd16单抗、5.0μg/ml il-15、5.0μg/mlil-18。
117.2、nk细胞培养步骤参数与实施例4一致。
118.对比例4
119.1、按照实施例1的方法，构建表达cd64、il-2、4-1bbl、il-21融合蛋白的滋养层细胞(k562)。
120.2、培养基配制：
121.培养基：每1000ml培养基+50ml自体血浆。
122.3、nk细胞培养步骤参数与实施例2一致。
123.对比例5
124.1、按照实施例1的方法，构建表达4-1bbl、il-21、il-12融合蛋白的滋养层细胞。(k562)
125.2、培养基配制：
126.培养基：每1000ml培养基+50ml自体血浆。
127.3、nk细胞培养步骤参数与实施例2一致。
128.效果鉴定
129.nk细胞形态如图5～6，采用流式细胞仪检测并统计各组细胞的扩增倍数(实验组a～c的流式检测结果如图2～4)
130.在即将收获nk细胞时，准备一定数量的处于对数生长期的四种肿瘤细胞：k562、hepg2、a549、hela(购于atcc)；
131.采用测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(ldh)活性进而测定细胞损害的方法，运用cytotoxicity ldh assay kit-wst，设置杀伤比5:1，10:1，20:1，孵育4小时；
132.使用酶标仪(带有490nm滤光片)测定吸光值；
133.细胞损伤率(％)＝[(a-b-e)/(c-d-e)]
×
100％
[0134]
a：e+t孔的吸光度-背景blank的吸光度
[0135]
b：e低对照孔的吸光度-背景blank的吸光度
[0136]
c：t高对照孔的吸光度-背景blank的吸光度
[0137]
d：t高对照blank的吸光度-背景blank的吸光度
[0138]
e：t低对照的吸光度-背景blank的吸光度
[0139]
计算得出nk细胞针对四种癌细胞的杀伤率(图7)，和nk细胞活化受体(图8)。
[0140]
表1 nk细胞的活率、扩增倍数、表型
[0141]
批次nk初始数量细胞活率(％)细胞总量nk细胞含量(％)扩增倍数实验组a1.2
×
10798.5％1.5
×
10
10
97.1％1213实验组b1.1
×
10799.2％1.8
×
10
10
95.2％1557实验组c1.1
×
10798.9％1.6
×
10
10
97.2％1413对比例11.2
×
10788.1％3.1
×
10950.5％130对比例21.1
×
10787.1％3.3
×
10961.4％184对比例31.3
×
10790.1％2.8
×
10962.3％134对比例41.2
×
10786.8％3.5
×
10978.2％228对比例51.3
×
10788.4％3.3
×
10980.5％204
[0142]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。