一种富硒酵母菌、益生菌复合菌液以及发酵豆粕饲料

1.本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种富硒酵母菌、益生菌复合菌液以及发酵豆粕饲料。


背景技术：

2.硒元素作为动物生长的必备元素之一，其对动物的生长和繁殖有着至关重要的促进作用，同时其对免疫系统的促进能力可以使动物增强自身抵抗力，因此在动物养殖过程中进行适量的添加是大有裨益的。
3.硒在动物养殖中的作用：
①
动物生长过程必须摄取适量的硒元素，一旦摄取不足，会出现机体免疫功能紊乱，造成机体坏死以及纤维变性等后果。
②
硒元素具有抗氧化作用，这对哺乳动物而言至关重要，其体内的多种硒蛋白都需要通过硒元素进行过氧化反应，从而对其细胞膜形成防护，极大地提升其成活率。
③
硒对于雄性和雌性动物的生殖系统都有增强作用，这一点在动物繁殖试验中得到了科学证实，因此积极投喂含硒饲料可以增加其繁衍能力，从而推动养殖业的发展。
④
对于养殖场而言，最容易造成重大损失的就是动物出现大规模的疾病，而使用硒饲料添加剂，可以促进淋巴细胞的生长，助力抵抗病原体的感染，在源头上对疾病进行预防。
4.当前最常见的方式是添加亚硒酸钠，这种方式虽然在一定程度上实现了硒元素的补充，但其利用率过低，加之自身的毒性，其使用存在着较大的局限性。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种富硒酵母菌、益生菌复合菌液以及发酵豆粕饲料。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明实施例提供了一种富硒酵母菌，其保藏号选自cctcc m 20211562、cctcc m 20211563和cctcc m 20211564中任意一种。
9.第二方面，本发明实施例提供了一种富硒发酵产物，由前述实施例所述的富硒酵母菌发酵获得。
10.第三方面，本发明实施例提供了一种益生菌复合菌液，其包括如前述实施例所述的富硒发酵产物。
11.第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的富硒酵母菌、或如前述实施例所述的富硒发酵产物、或如前述实施例所述的益生菌复合菌液在养殖动物或制备饲料中的应用。
12.第五方面，本发明实施例提供了一种发酵豆粕饲料的制备方法，其包括：对豆粕与如前述实施例所述的益生菌复合菌液的混合物进行发酵。
13.第六方面，本发明实施例提供了一种发酵豆粕饲料，其由前述实施例所述的发酵豆粕饲料的制备方法制备获得。
14.本发明具有以下有益效果：
15.本发明经一系列筛选培养，提供了3株具有较强富硒能力的酵母菌株，保藏号分别为cctcc m 20211562、cctcc m 20211563和cctcc m 20211564，相对于现有的酵母菌而言，这3株富硒酵母菌具有更强的富硒功能，将应用于动物饲料的制备，能够更有效避免或减少动物生长过程中因摄入硒不足而导致的一系列问题，提高动物的免疫力以及存活率，降低养殖成本。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
17.图1为从土壤中分离出的3株富硒酵母的菌落形态；
18.图2为试验例1中酵母pik-03对应制备的发酵豆粕(不同水分含量)发酵后的有机硒含量；
19.图3为试验例1中3株富硒菌发酵完后豆粕中水分的含量。
具体实施方式
20.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
21.首先，本发明实施例提供了一种富硒酵母菌，其保藏号选自cctcc m 20211562、cctcc m 20211563和cctcc m 20211564中任意一种。
22.本技术发明人从恩施州富硒土壤中通过微生物菌种初筛、复筛、液体深层培养，发现3株菌具有较强的富硒能力，经18s rdna测序鉴定(序列相似度大于99％或其以上)为酿酒酵母和毕赤酵母属。
23.3株菌种均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学保藏中心，邮编：430072；保藏编号以及日期如下：
24.酿酒酵母pik-01(对应的分类学拉丁文学名为saccharomyces cerevisiae)，保藏号：cctcc m 20211562，保藏日期为2021年12月07日；
25.酿酒酵母pik-02(对应的分类学拉丁文学名为saccharomyces cerevisiae)，保藏号：cctcc m 20211563，保藏日期为2021年12月07日；
26.毕赤酵母pik-03(对应的分类学拉丁文学名为pichia kudriavzevii)，保藏号：cctcc m 20211564，保藏日期为2021年12月07日。
27.本发明实施例还提供了一种富硒发酵产物，由前述实施例所述的富硒酵母菌发酵获得。
28.在没有限定的情况下，所述富硒酵母菌的发酵条件可以参照现有发酵酵母菌的发酵条件，在相同的发酵条件下，本发明提供的酵母菌相对于现有的其他酵母菌而言具有更
突出的富硒功能。
29.优选地，所述富硒发酵产物是发酵后分离收集的菌泥。菌泥可以通过对发酵后的产物进行离心，去除上清液，取沉淀物(菌泥)获得，离心的次数可以为2～3次。
30.优选地，所述发酵的过程包括：在发酵培养基中添加亚硒酸钠，发酵培养60～80h，发酵的温度为28℃；在可选的实施方式中，发酵培养的时间包括但不限于60h、62h、64h、66h、68h、70h、72h、74h、76h、78h、80h中的任一项或任两项之间的范围。
31.优选地，所述亚硒酸钠的添加量为：每(1～9)
×
10
11
活菌数的富硒酵母菌，添加20～2.5mg的亚硒酸钠。在一些实施例中，每100ml培养液对应(1～9)
×
10
11
活菌数的富硒酵母菌，更优选为3
×
10
11
活菌数的富硒酵母菌，因此在添加时，也可以对应根据培养液的体积进行添加。
32.本发明还提供了一种益生菌复合菌液，其包括如前述实施例所述的富硒发酵产物。
33.将上述益生菌复合菌液应用于动物饲料的制备，能够显著提高饲料中的富硒量，为动物提供优质的有机硒含量，且利用率高，使用效果好，能有效避免或减少动物生长中因硒的摄取不足而导致的问题，能够提高动物免疫力，降低疾病的发生，提高养殖动物的存活率；此外，增加饲料中的硒含量还能显著提高动物的繁殖能力，对于提高养殖质量，降低养殖成本，具有非常积极的作用。
34.优选地，所述益生菌复合菌液还包括乳酸杆菌，粘液红酵母，马克斯克鲁维酵母菌中至少一种菌的菌液，乳酸杆菌，粘液红酵母，马克斯克鲁维酵母菌是经一系列筛选后获得的，相对于其他菌种而言，能进一步提高富硒酵母菌在饲料中的稳定性，使得富硒酵母菌能够更加充分有效的发挥其富硒的功能，优选为乳酸杆菌、粘液红酵母和马克斯克鲁维酵母菌的组合，这三种菌能够与富硒酵母菌一起协同增效，显著稳健地提高富硒效果。
35.优选地，当所述益生菌复合菌液还包括乳酸杆菌，粘液红酵母，马克斯克鲁维酵母菌时，乳酸杆菌，粘液红酵母，马克斯克鲁维酵母菌以及所述富硒发酵产物中富硒酵母菌的活菌数比为(480～520)：(480～520)：(480～520)：(200～250)，在此配比下，具有更好的效果。
36.本发明实施例还提供了如前述实施例所述的富硒酵母菌、或如前述任意实施例所述的富硒发酵产物、或如前述任意实施例所述的益生菌复合菌液在养殖动物或制备饲料中的应用。
37.优选地，所述饲料的施用对象为猪、蛋鸡中任意一种。
38.本发明实施例提供了一种发酵豆粕饲料的制备方法，其包括对豆粕与如前述任意实施例所述的益生菌复合菌液的混合物进行发酵。
39.优选地，所述混合物中各组分的比例为：每公斤豆粕，对应(1～9)
×
10
14
活菌数的益生菌复合菌液，优选为4.67
×
10
14
活菌数。
40.优选地，所述发酵的条件为30～40℃，110～130h。具体地，发酵温度可以为30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃中的任意一项或任意两项之间的范围，发酵时间可以为110h、112h、114h、116h、118h、120h、122h、124h、126h、128h、130h中的任意一项或任意两项之间的范围。
41.优选地，所述制备方法还包括先将豆粕、葡萄糖以及水混合。
42.优选地，豆粕、葡萄糖以及水的质量比为(60～80):(5～15):(10～30)，更有选为70:10:20。
43.此外，本发明实施例提供了一种发酵豆粕饲料，其由前述任意实施例所述的发酵豆粕饲料的制备方法制备获得。
44.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
45.实施例中使用的材料与试剂
46.(1)试剂
47.采自湖北恩施市山区的土壤，葡萄糖，酵母粉，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，牛肉膏，蛋白胨，柠檬酸氢二铵，硫酸锰，硫酸镁，孟加拉红，乙酸钠，氯霉素，吐温80，氯化钠，亚硒酸钠等。
48.(2)培养基
49.酵母培养基ypd(g/l)：10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖，去离子水溶解后定容至1l，121℃灭菌15min，固体培养基成分在液体的基础上添加20g琼脂粉。
50.lb培养基(g/l)：5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g nacl，使用去离子水溶解后定容至1l，使用5mol/l的naoh调节ph至7.0。
51.mrs乳酸菌培养基(g/l)：蛋白胨10g，牛肉膏8g，酵母提取物4g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温80 1ml，使用去离子水溶解后定容至1l。
52.孟加拉红培养基(g/l)：蛋白胨5g，葡萄糖10g，硫酸镁0.5g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，磷酸二氢钾1g，琼脂20g。
53.种子液的制备：从保藏的菌种斜面上取一环菌体接种于100ml液体种子培养基中，于28℃、220rpm摇床培养48h制备种子培养液。
54.实施例1
55.富硒酵母的筛选
56.1.1耐硒菌的筛选
57.将收集的土壤样本，使用无菌水震荡30min，静置2min，待砂砾和大颗粒固体杂质沉降后重新收集上层悬浮液，悬浮液4℃保存备用。
58.取2ml制备好的样品分别使用无菌水进行梯度稀释，将稀释好的样品分别加入含有120μg/ml亚硒酸钠的固体lb平板，稀释后涂平板结合划线分离，得到耐硒微生物的单菌落菌株。
59.1.2富硒菌种的鉴定
60.使用ctab法提取富硒细菌基因组dna，以提取的基因组dna为模板16srna和18srna为引物做pcr，将产物进行测序，将测序结果在ncbi中进行比对。
61.使用引物为：
62.18s-ns1：5
’‑
gtagtcatatgcttgtctc-3’；
63.18s-ns8：5
’‑
tccgcaggttcacctacgga-3；
64.16srdna-f：5
’‑
ctgaagagtttgatcctggctc-3’；
65.16srdna-r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3。
66.富硒菌株saccharomyces cerevisiae strain pik-01 18s rdna序列(5
’‑3’
)：
67.tgtctagtatagcatttatacagtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagttcctttactacatggtataactgtggtaattctagagctaatacatgcttaaaatctcgaccctttggaagagatgtatttattagataaaaaatcaatgtcttcggactctttgatgattcataataacttttcgaatcgcatggccttgtgctggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtttcaacgggtaacggggaataagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctaattcagggaggtagtgacaataaataacgatacagggcccattcgggtcttgtaattggaatgagtacaatgtaaataccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaactttgggcccggttggccggtccgattttttcgtgtactggatttccaacggggcctttccttctggctaaccttgagtccttgtggctcttggcgaaccaggacttttactttgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcgtattgctcgaatatattagcatggaataatagaataggacgtttggttctattttgttggtttctaggaccatcgtaatgattaatagggacggtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaattcttggatttattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggacgttttcttaatcaagaacgaaaggtaggggatcgaaatgatcagataccgtcgtatcttaccataaatatgcgactaggggatcgggtggtgttttttatgaccactcggacctacagaaactcaagctttgggttcttggggggaatatggcccaggtgaacttaaggattgcggaggggccccccggatggacctgcg。
68.富硒菌株saccharomyces cerevisiae strain pik-02 18s rdna序列(5
’‑3’
)：
69.atgtctagtatagcaatttatacagtgaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagttcctttactacatggtataactgtggtaattctagagctaatacatgcttaaaatctcgaccctttggaagagatgtatttattagataaaaaatcaatgtcttcggactctttgatgattcataataacttttcgaatcgcatggccttgtgctggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtttcaacgggtaacggggaataagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctaattcagggaggtagtgacaataaataacgatacagggcccattcgggtcttgtaattggaatgagtacaatgtaaataccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaactttgggcccggttggccggtccgattttttcgtgtactggatttccaacggggcctttccttctggctaaccttgagtccttgtggctcttggcgaaccaggacttttactttgaaaaaattagagtgttcaaagcaggcgtattgctcgaatatattagcatggaataatagaataggacgtttggttctattttgttggtttctaggaccatcgtaatgattaatagggacggtcgggggcatcagtattcaattgtcagaggtgaaattcttggatttattgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggacgttttcattaatcaagaacgaaagttaggggatcgaagatgatcagataccgtcgtagtcttaccataactatgccactagggatcgggtggggtttttaatgaccactcggacctacgaaatcaaagctttgggtctggggggagttggtcgcaggtgaacttaaggattgcggagggcccccaggatggacctgcgttatttgctcaccggg。
70.富硒菌株pichia kudriavzevii strain pik-03 18s rdna序列(5
’‑3’
)
71.agtataagcattatacggtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagttccgttctacatggataaccgtggaaaatctagagctaatacatgcgtaaagccccgacttcgggaggggtgtatttattagataaaaaatcaatgccctcgggccttttgatgattcataataacttttcgaagctcatggccttgcgccggagctggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagaggcctaccatggttttcacgggtaacggggaataagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcctgacacagggaggtagtgacaatatataacgatacagggcctttggtcttgtaattggaatgagtacaatgtaaataccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaata
gcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaactttgggcctgggcggacggtctacctatggtaagcactgttgcggccgggtctttccttctggctagccctcgggcgaaccaggacgattactttgaggaaattagagtgttcaaagcaggcctttgctcggatatattagcatggaataatagaataggacgcatggttctattttgttggtttctaggaccatcgtaatgattaatagggacggtcgggggcatcagtattcagtcgtcagaggtgaaattcttggattgactgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggacgttttcattaatcaagaacgaaagttaggggatcgaagatgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcgggtggtgctactttgcccactcggcaccttacgagaaatcaaagtttttgggttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacgtaataaggattgacaagttagagacttctcttgatcttacgggtggtggtgcatggccgtttttagtccttggagtgatttgtctgcttaattgcgataacggacgagaccttaacctgctaaatagggctgcgagcatctgctcgggtgctcttcttagagggactatgggtatcaaacccatggaagtttgaggcaacaacaggtctgtgatgcccttagacgttctgggccgcacgcgcgctacactgacggagccagcaagtccaaccttggtcgagaggcccgggtaatctcgtgaaactccgtcgtgctggggatagagcattgtaatttttgctcttcaacgaggaattcctagtaagcgcaagtcatcagcttgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaatggcttagtgaggcttcaagattggcgccgcgggaggggcaactttcccatggggccgagaatctagtcaaacttggtcattagaggtcgtaaa。
72.1.3筛选结果
73.从恩施州富硒土壤中通过微生物菌种初筛、复筛、液体深层培养，发现了3株菌具有较强的富硒能力，经18s rdna测序鉴定为酿酒酵母和毕赤酵母属(序列比对结果：相似度≥99％)。菌种保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，分别为：酿酒酵母pik-01，保藏号：cctccm 20211562；酿酒酵母pik-02，保藏号：cctcc m 20211563；毕赤酵母pik-03，保藏号：cctcc m 20211564。3株酵母菌菌落形态如图1。
74.1.4种子培养液制备
75.分别将分离出的菌株接种在斜面培养基上得到斜面菌株，然后将所得到的斜面菌株接种于液体种子培养基中，得到对应的种子培养液。
76.1.5发酵培养
77.将种子培养液按照体积百分含量10％的接种量接种至发酵培养基中，在28℃、220rpm摇菌6h，6h后在发酵培养基中每1ml的培养液(每100ml培养液对应3
×
10
11
的富硒酵母菌)添加20μg～25μg的亚硒酸钠，最终100ml的培养液中含亚硒酸钠2mg～2.5mg，继续在28℃培养箱中发酵培养72h，获得发酵液。
78.1.6富硒菌转化效率筛选
79.将获得的发酵液4000rpm离心20min，去除上清液，并用不含亚硒酸钠的发酵培养液重新悬浮离心，重复3次，得到不含亚硒酸钠的菌体。
80.将菌体放入真空冷冻干燥机中冻干48h。
81.将冻干好的菌体研磨粉碎成菌粉装入新的离心管中，连同不添加亚硒酸钠的空白对照一同送至湖北省农科院质检所检测菌粉中的有机硒含量，筛选出富硒能力最强且无致病性的菌种。
82.检测结果表明，在每1ml的培养液中添加20μg的亚硒酸钠时，pik-03菌株富硒能力最强，可达到1500mg/kg(表1)。
83.表1 不同菌株在不同亚硒酸钠添加量中的有机硒含量(mg/kg)
84.亚硒酸钠含量(μg/ml)0152025pik-011.91593740537pik-021.97733572739pik-0310.497215001200
85.实施例2
86.发酵豆粕饲料的制备
87.2.1发酵活性富硒菌的制备
88.分别将实施例1富硒完成的发酵液转移至无菌的离心管中，4000rpm离心15min，去除上清液，并用无菌的ypd培养基将离心后的菌体重悬离心共3次，用来洗去培养液中的亚硒酸钠，在洗净培养基中的亚硒酸钠后，离心去除上清将下层菌体密封放入4℃冰箱保存。
89.2.2发酵复合菌种的制备
90.①
将乳酸杆菌lact-6接种在斜面培养基上37℃培养48h，得到斜面菌株，斜面培养基为lb培养基添加1.5％的琼脂；
91.将得到的斜面菌株使用无菌接种环接种至lb液体培养基中，在37℃恒温摇床中220rpm培养48h。
92.②
将粘液红酵母rh.mu-4，马克斯克鲁维酵母klma-2接种在斜面培养基上28℃培养48h，得到斜面菌株，斜面培养基为ypd培养基添加1.5％的琼脂；
93.将得到的斜面菌株使用无菌接种环接种至ypd液体培养基中，在28℃恒温摇床中220rpm培养48h；
94.培养完成后4000rpm离心10min去除上清液只保留下层菌体。
95.③
富硒酵母的制备方法同实例2中2.1发酵活性富硒菌的制备。
96.2.3益生菌复合菌体制备
97.将发酵后获得的富硒酵母菌培养液、乳酸杆菌培养液，粘液红酵母培养液以及马克斯克鲁维酵母培养液按培养基体积比为226：500：500：500混合离心后获得益生菌复合活菌体。
98.2.4发酵豆粕饲料的制备
99.将豆粕，葡萄糖，水按照70:10:20混合，混合后，每公斤豆粕添加离心后总培养液1726ml的益生菌复合菌体混合搅拌均匀，在36℃恒温条件下发酵120h。
100.试验例1
101.样品检测
102.3.1感官检测
103.取实施例2发酵后的样品(pki-03对应的发酵豆粕)进行感官评测，评价发酵饲料的有无腐败刺激性气味气味，是否有霉菌菌斑等。
104.3.2理化指标
105.3.2.1水分检测
106.称取发酵样品1g(精确到mg)装入已经称重的50ml离心管中，用封口膜封口并在膜上扎上通气孔，方便样品烘干。将盛有样品的50ml离心管放入真空烘箱中抽真空80℃烘干4h，在烘箱中自然冷却至室温后，转移至干燥器中，称重计算损失的质量。
107.3.2.2ph检测
108.称取1g发酵后样品与10ml离心管中，使用生理盐水定容至10ml，充分涡旋振荡混匀，静置5min后使用ph仪检测上层液体ph值。
109.3.2.3活菌落检测
110.①
称取1g样品于10ml灭菌离心管中，使用灭菌后的生理盐水定容至10ml，振荡5min，静置，取上层液体进行梯度稀释至105倍备用。
111.②
提前制备mrs固体平板和孟加拉红平板，将
①
中准备的上层液体分别吸取200μl加入至mrs和孟加拉红平板中，涂匀后mrs平板倒置放入37℃恒温箱中培养2d，孟加拉红平板倒置放置28℃恒温箱中培养2d，培养完成后使用统计平板上的单菌落数。
112.3.2.4硒含量检测
113.称取样品0.5-3g(精确至0.001g)或准确移取液体试样1-5ml，置于锥形瓶中，向锥形瓶中添加10ml硝酸-高氯酸混合酸(9+1)及几粒玻璃珠，盖上表面皿冷消化过夜。
114.第二天于电热板上加热，并及时补加硝酸。当溶液变为清亮无色并伴有白烟产生时,再继续加热至剩余体积为2ml左右。冷却后再加5ml盐酸溶液(6mol/l)，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现。冷却后转移至10ml容量瓶中，加入2.5ml铁氰化钾溶液(100g/l)，用水定容，混匀待测。同时做试剂空白试验。
115.以盐酸溶液(5+95)为载流，硼氢化钠碱溶液(8g/l)为还原剂，连续用标准系列的零管进样，待读数稳定之后，将空白溶液和试样溶液分别导入仪器，测荧光值强度，最后用标准系列比对定量。
116.3.3豆粕检测结果
117.发酵后样品无霉斑，无腐败刺激性气味，有酒精香气。
118.发酵前豆粕中有机硒的含量为0.4mg/kg，经过5d发酵后有机硒含量能达到1.58mk/kg(图2)，发酵完成后测得相较于发酵前水分含量增加5％～10％(图3)。
119.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。