1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种地顶孢霉的发酵工艺及培养基。
背景技术：
2.地顶孢霉是一种虫草真菌，它多是寄生于虫草之中，能够合成多种药理活性物质，其菌丝体及培养物含有多类药理活性成分，经测试，这些药理活性成分具有体外抗肿瘤活性以及增强动物体内免疫活性的功能，因此可用于饲料添加剂及药品和保健食品的制备。
3.地顶孢霉培养物是由从古尼虫草分离的地顶孢霉菌经人工发酵而得到的产品，拥有虫草素、虫草酸、多糖、腺苷等与古尼虫草相似的功能性成分，人工发酵得到的地顶孢霉培养物成本大大降低。
4.专利cn1259570a公开的发酵工艺中，地顶孢霉发酵周期为48-60h，发酵完成后采用超膜过滤后喷雾干燥的方法来获取地顶孢霉培养物，培养物中的腺苷含量较低。专利cn103756916a公开地顶孢霉成品腺苷含量也仅为1.0mg/g左右。可见，现有技术对地顶孢霉的发酵时间长，培养物腺苷含量低，后期获取培养物工序繁琐，成本耗能高，且有效成分含量低，存在较多缺陷，不适合大规模工厂化生产，亟待改进。
技术实现要素：
5.本发明针对现有技术的不足，提出了一种地顶孢霉的发酵工艺及培养基。
6.本发明的目的一是提供了一种地顶孢霉的发酵工艺，具体包括如下步骤：（1）将地顶孢霉接种到斜面pda固体培养基上，于25.0
±
2℃培养6d，制得斜面菌种；（2）将斜面试管菌种进行一级摇瓶培养，然后移至二级摇瓶中进行种子培养，培养条件均为25.0
±
2℃，培养3d，得二级摇瓶培养液；其中，摇瓶培养基为：麸皮5.0%(煮沸0.5h，取滤液)、葡萄糖1.5-2.0%、蛋白胨0.5-0.6%、磷酸二氢钾0.08-0.1%、硫酸镁0.02-0.03%，ph值自然。
7.（3）将二级摇瓶培养液按接种量2%接种到装有种子培养基的发酵罐中培养，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在220rpm，空气流量控制在1:1v/v/min，培养1d，得一级种子培养液；（4）待一级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到装有种子培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，培养10-16h，得二级种子培养液；其中，步骤（3）（4）所使用的种子培养基为：葡萄糖1.5-2%，蛋白胨0.5-0.6%，硫酸镁0.07-0.08%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2%，豆油0.07-0.08%，ph5-6。
8.（5）待二级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，ph降至3.5左右，糖点在1.0%时放罐，得到发酵液；
其中，发酵培养基为：蔗糖1.25-1.5%，葡萄糖1.25-1.5%，蛋白胨0.5-0.6%，酵母粉0.6-0.7%，硫酸镁0.05-0.06%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2.0%，磷酸氢二钾0.12-0.15%，硫酸铵0.05-0.06%，ph 5.6-6.0；本发明的目的二是提供一套用于地顶孢霉发酵的培养基，具体内容如下：（1）菌种斜面培养基：pda固体培养基；（2）摇瓶培养基：麸皮5.0%(煮沸0.5h，取滤液)、葡萄糖1.5-2.0%、蛋白胨0.5-0.6%、磷酸二氢钾0.08-0.1%、硫酸镁0.02-0.03%，ph值自然；（3）种子培养基：葡萄糖1.5-2%，蛋白胨0.5-0.6%，硫酸镁0.07-0.08%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2%，豆油0.07-0.08%，ph5-6；（4）发酵培养基：蔗糖1.25-1.5%，葡萄糖1.25-1.5%，蛋白胨0.5-0.6%，酵母粉0.6-0.7%，硫酸镁0.05-0.06%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2.0%，磷酸氢二钾0.12-0.15%，硫酸铵0.05-0.06%，ph5.6-6.0。
9.发酵培养基中不同配比及不同的发酵工艺能显著影响菌体的生长。本发明科学地调配发酵培养基中各营养物质的含量，精确控制发酵工艺，不仅能够促进地顶孢霉的生长，而且能够显著提高腺苷等代谢物的含量，提高了地顶孢霉培养物的使用价值。
10.与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：本发明提供的发酵培养基不仅短周期内够促进地顶孢霉的快速大量繁殖，而且显著提高了菌体中腺苷的含量；本发明提供的发酵工艺采用液体发酵技术，对各项发酵参数进行了优化，发酵工艺操作简单，可适用于地顶孢霉培养物的大量获得。
11.本发明的有益效果在于：发酵培养基与传统的发酵培养基相比，缩短了培养时间，大大降低了生产成本以及水电气等能源损耗，显著提高了地顶孢霉中腺苷的含量。本发明提供的发酵工艺适合大规模工业化生产，并可根据市场的需求增加或缩减生产规模，其产品是一种功能型的饲料添加剂，在农业部《饲料添加剂品种目录》范围内，可用于饲喂鸡、猪。
具体实施方式
12.下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
13.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
14.下述实施例中所使用的地顶孢霉菌株保藏于甘肃省微生物菌种保藏中心。
15.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
16.下述实施例中所使用的培养基如下：pda固体培养基：马铃薯15-20.0%（去皮，煮沸0.5h，取滤液），葡萄糖1.5-2.0%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.12-0.15%，琼脂1.5-2.0%，加水至1000ml ，ph值自然。
17.摇瓶培养基：麸皮5.0%(煮沸0.5h，取滤液)、葡萄糖1.5-2.0%、蛋白胨0.5-0.6%、磷酸二氢钾0.08-0.1%、硫酸镁0.02-0.03%，ph值自然。
18.种子培养基：葡萄糖1.5-2%，蛋白胨0.5-0.6%，硫酸镁0.07-0.08%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2%，豆油0.07-0.08%，ph5-6。
19.实施例1使用下述工艺发酵地顶孢霉：（1）将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于25.0
±
2℃培养6d，制得斜面菌种；所用斜面培养基为pda固体培养基；（2）将斜面菌种在摇瓶培养及中进行一级摇瓶培养，然后移至二级摇瓶中进行种子培养，于25.0
±
2℃培养3d，得二级摇瓶培养液；（3）将二级摇瓶培养液按2%接种量接种到装一级种子培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在220r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，培养1d，得一级种子培养液；（4）待一级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到装有种子培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，培养10-16h，得二级种子培养液；（5）待二级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:1v/v/min。ph降至3.5左右，糖点在1.0%时放罐，得到发酵液。
20.在相同的发酵工艺下，根据所使用的发酵培养基的不同分为以下六个实验组：1.实验组1发酵培养基配方为：蔗糖1.5-1.8%，葡萄糖1.5-1.8%，蛋白胨0.5-0.6%，豆油0.07-0.08%，硫酸镁0.07-0.08%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2.0%，磷酸氢二钾0.12-0.15%，硫酸铵0.04-0.05%，ph5.6-6.0；2.实验组2发酵培养基配方为：蔗糖1.25-1.5%，葡萄糖1.25-1.5%，蛋白胨0.5-0.6%，豆油0.07-0.08%，硫酸镁0.07-0.08%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2.0%，磷酸氢二钾0.12-0.15%，硫酸铵0.04-0.05%，ph5.6-6.0；3.实验组3发酵培养基配方为：蔗糖1.5-1.8%，葡萄糖1.5-1.8%，蛋白胨0.5-0.6%，酵母粉0.6-0.7%，硫酸镁0.05-0.06%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2.0%，磷酸氢二钾0.12-0.15%，硫酸铵0.05-0.06%，ph5.6-6.0；4.实验组4发酵培养基配方为：蔗糖1.25-1.5%，葡萄糖1.25-1.5%，蛋白胨0.5-0.6%，酵母粉0.6-0.7%，硫酸镁0.05-0.06%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2.0%，磷酸氢二钾0.12-0.15%，硫酸铵0.05-0.06%，ph5.6-6.0。
21.5.实验组5发酵培养基配方为蔗糖1.8-2.0%，葡萄糖1.8-2.0%，蛋白胨0.5-0.6%，豆油0.07-0.08%，硫酸镁0.07-0.08%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2.0%，磷酸氢二钾0.12-0.15%，硫酸铵0.04-0.05%，ph5.6-6.0；6.实验组6发酵培养基配方为蔗糖1.8-2.0%，葡萄糖1.8-2.0%，蛋白胨0.5-0.6%，酵母粉0.07-0.08%，硫酸镁0.07-0.08%，磷酸二氢钾0.12-0.15%，黄豆饼粉1.5-2.0%，磷酸氢二钾0.12-0.15%，硫酸铵0.04-0.05%，ph5.6-6.0；将上述各实验组发酵液离心，65
±
5℃烘箱内烘干至恒重高效液相色谱法（ny/t 2116-2012标准，本标准适用于虫草原料、虫草产品中虫草素和腺苷的测定）测成品腺苷含量，实验结果如下表1所述。
22.表1不同组发酵培养基后成品腺苷含量：组别腺苷含量mg/g
实验组11.76实验组22.13实验组33.33实验组44.35实验组51.78实验组62.23由表1可知，实验组4中成品腺苷含量高于实验组1、2、3，说明实验组4为最佳实施例。与实验组5、6相比，实验组4中成品腺苷含量显著的提高，说明本发明酵母粉代替豆油的变化能显著影响发酵液菌体繁殖，从而影响最终的成品腺苷含量。
23.实施例2采用相同的培养基，即实施例1中实验组4的培养基配方，不同的发酵条件发酵地顶孢霉，具体实验分组如下：1. 实验组7：采用实施例1所述的发酵条件。
24.2. 实验组8：（1）将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于25.0
±
2℃培养6d，制得斜面菌种，所用斜面培养基为pda固体培养基；（2）将斜面菌种进行一级摇瓶培养，然后移至二级摇瓶中进行种子培养，于25.0
±
2℃培养3d，得二级摇瓶培养液；（3）将二级摇瓶培养液按2%接种量接种到装一级种子培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在220r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，培养1d，得到一级种子培养液；（4）待一级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到装由种子培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，培养10-16h，得到二级种子培养液；（5）待二级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在27.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:1v/v/min。ph降至3.5左右，糖点在1.0%时放罐，得到发酵液。
25.3. 实验组9：（1）将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于25.0
±
2℃培养6d，制得斜面菌种；所用斜面培养基为pda固体培养基；（2）将斜面菌种进行一级摇瓶培养，然后移至二级摇瓶中进行种子培养，于25.0
±
2℃培养3d，得二级摇瓶培养液；（3）将二级摇瓶培养液按2%接种量接种到装一级种子培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在220r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，培养1d，得到一级种子培养液；（4）待一级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到装有种子培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，培养10-16h，得到二级种子培养液；（5）待二级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到
装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:0.5v/v/min。ph降至3.5左右，糖点在1.0%时放罐，得到发酵液。
26.4. 实验组10：（1）将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于25.0
±
2℃培养6d，制得斜面菌种；所用斜面培养基为pda固体培养基；（2）将斜面菌种进行一级摇瓶培养，然后移至二级摇瓶中进行种子培养，于25.0
±
2℃培养3d，得二级摇瓶培养液；（3）将二级摇瓶培养液按2%接种量接种到装一级种子培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在220r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，得到一级种子培养液；（4）待一级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到装有种子培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在25.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:1v/v/min，培养1d，得到二级种子培养液；（5）待二级种子培养液ph降至3.5左右，糖点在1.0%左右开始按25%接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中培养温度控制在27.0
±
2℃，搅拌转速控制在180r/min，空气流量控制在1:0.5v/v/min。ph降至3.5左右，糖点在1.0%时放罐，得到发酵液。
27.5. 实验组11与实施例7的区别在于，所述培养基用培养条件温度控制在26
±
0.3℃，其它均与实施例7相同。
28.6. 实验组12与实施例9的区别在于，所述培养基用培养条件温度控制在26
±
0.3℃，其它均与实施例9相同。
29.将上述各实验组发酵液离心，65
±
5℃烘箱内烘干至恒重高效液相色谱法（ny/t 2116-2012标准，本标准适用于虫草原料、虫草产品中虫草素和腺苷的测定）测成品腺苷含量。实验结果如下表2所述。
30.表2不同组发酵工艺后成品腺苷含量：组别腺苷含量mg/g实验组74.11实验组82.13实验组92.63实验组101.51实验组113.34实验组122.54由表2可知，实验组7中成品腺苷含量最高，说明实验组5为最佳实施例。与实验组11、12相比，实验组7中成品腺苷含量显著的提高，说明本发明温度和空气流量的变化能显著影响发酵液菌体繁殖，从而影响最终的成品腺苷含量。
31.由以上可知，本发明发酵培养基及发酵工艺不仅发酵周期短，成品腺苷量高，可达
到4.0mg/g以上，而且发酵工艺采用液体发酵技术，对各项发酵参数进行了优化，发酵工艺操作简单，大大降低了生产成本和水电气等的损耗，可适用于地顶孢霉培养物的大量获得。