一种鉴别谷子叶酸性状的SNP位点、KASP分子标记引物组及其应用

一种鉴别谷子叶酸性状的snp位点、kasp分子标记引物组及其应用


背景技术：

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别谷子叶酸性状的snp位点、kasp分子标记引物组及其应用。
技术领域
2.谷子是我国重要的粮食作物之一，种植面广，受众面广。随着环境和人们生活需求的改变，优良谷子品种的选育工作仍然势在必行。谷子品种的选育主要包括传统杂交育种和现代分子标记选育技术，传统杂交育种依靠天然基因的不同组合，首先需要选择目的性状优良的父本和母本，该方法对杂交方法和设备要求不高，但是耗时长。
3.现代分子标记选育技术是近年来逐渐兴起的育种技术，利用分子标记能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特性，能够针对谷子不同性状进行选育，目的性更强，效果更佳明显，且耗时短，所以是目前谷子品种选育的热门技术。
4.叶酸是一种水溶性维生素，是维持生命活动的重要维生素，其能够参与遗传物质和蛋白质的代谢，促进动物繁殖和生长和提高免疫力。目前妊娠妇女或者计划妊娠妇女均提倡服用叶酸，用以预防胎儿发育缺陷。因此培育高叶酸含量的谷子品种，对于提高人膳食中叶酸的摄入量具有重要健康价值。然而，现有技术并未出现关于谷子叶酸分子标记的研究。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鉴别谷子叶酸性状的snp位点、kasp分子标记引物组及其应用，快速筛选和鉴定谷子叶酸性状，提高高叶酸谷子种质的选育效率。
6.本发明提供了一种鉴别谷子叶酸性状的snp位点，所述snp位点位于谷子siadcl1基因第1号外显子上，且在第1号外显子的164bp处多态性为t/c。
7.优选的，所述snp的多态性位点位于seq id no.1所示的核苷酸序列的第164bp处，且多态性为t/c。
8.本发明还提供了一种鉴别上述snp位点的kasp分子标记引物组，包括序列为seq id no.3所示的正向引物1、序列为seq id no.4所示的正向引物2和序列为seq id no.5所示的反向引物。
9.本发明还提供了一种用于检测上述snp位点的试剂盒，包括上述的kasp分子标记引物组；
10.所述引物组中正向引物1和正向引物2的使用浓度独立为4～10μmol/l；所述引物组中的反向引物的浓度为4～10μmol/l。
11.本发明还提供了上述snp位点或kasp分子标记引物组在谷子育种中的应用。
12.本发明还提供了上述snp位点或kasp分子标记引物组在筛选高叶酸谷子中的应用。
13.本发明还提供了一种鉴别谷子叶酸性状的方法，包括如下步骤：
14.利用上述引物组对谷子基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
15.对所述扩增产物进行kasp基因分型检测，根据分型检测结果鉴别谷子叶酸性状；
16.所述谷子叶酸性状判定的方法为：当kasp基因分型检测结果为cc型时，鉴定谷子叶酸性状为高叶酸；当kasp基因分型检测结果为tt型或ct型时，鉴定谷子叶酸性状为非高叶酸。
17.优选的，所述pcr扩增使用的反应体系以10μl计包括：谷子基因组dna2μl，引物组0.14μl，2x probe mixa溶液5μl和余量的ddh2o；
18.所述pcr扩增反应的程序为：第一阶段95℃预变性10min；第二阶段95℃变性20s，61℃退火40s，共10个循环；第三阶段95℃变性20s，55℃退火40s，共31个循环；第四阶段25℃保持10min。
19.优选的，所述引物组中，正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比为2:2:5。
20.优选的，所述谷子基因组dna的浓度为50～100ng/μl。
21.本发明提供的snp位点，位于谷子siadcl1基因第1号外显子上，且在第1号外显子的164bp处多态性为t/c；当碱基为c时，所述谷子叶酸性状为高叶酸；当碱基为t时，所述谷子叶酸性状为低叶酸。利用该snp位点，能将谷子高叶酸和低叶酸区分开。
22.本发明采用kasp分子标记引物组对谷子叶酸性状进行选择，只需通过dna提取、pcr特异性扩增、kasp基因分型检测即可完成对样品的鉴别，能够得到高叶酸谷子，该分子标记物用于鉴定谷子叶酸是切实有效的，利用本发明分子标记辅助选择可提高高叶酸谷子种质选育效率，为谷子叶酸含量相关优异等位变异的利用提供依据，加快育种进程。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
24.图1为实施例1 siadcl上snp(t164c)的kasp实验结果；
25.图2为实施例1不同基因型材料叶酸含量分布情况。
具体实施方式
26.本发明提供了一种鉴别谷子叶酸性状的snp位点，含有位于谷子siadcl1基因第1号外显子上第164bp处多态性为t/c的核苷酸序列；碱基为c时，所述谷子叶酸性状为高叶酸。
27.在本发明中，所述snp位点位于谷子siadcl1基因第1号外显子上第164bp位点，所述位点上存在t/c碱基突变，与谷子叶酸具有显著的相关性。本发明所述snp位点优选含有如seq id no.1所示的核苷酸序列，所述snp的多态性位点位于第164bp处，且多态性为t/c。通过对所述snp位点进行分型可确定待测谷子叶酸性能：当所述位点为c碱基时，所述谷子叶酸性状为高叶酸；当所述位点为t碱基时，所述谷子无高叶酸性状。本发明所述snp位点位于siadcl1基因第1号外显子上，该基因的结构信息来源于谷子多组学数据库(http://foxtail-millet.biocloud.net/home)，用于查询的编号为si1g12410；ncbi登录号为xp_004952187，具体核苷酸序列如seq id no.2所示。
28.本发明提供了所述的snp位点的kasp分子标记，所述kasp分子标记的引物组包括序列为seq id no.3所示的正向引物1、序列为seq id no.4所示的正向引物2和序列为seq id no.5所示的反向引物。
29.本发明提供了用于检测所述的snp位点的试剂盒，包括所述引物组。本发明所述引物组中正向引物1和正向引物2的使用浓度优选独立为4～10μmol/l，进一步优选为5～8μmol/l，更优选为6～7μmol/l；所述引物组中的反向引物的浓度为4～10μmol/l，进一步优选为5～8μmol/l，更优选为6～7μmol/l。本发明对所述试剂盒中含有的其他组分不做严格要求，选择本领域熟知的能够用于检测所述的snp位点的试剂即可。
30.本发明还提供了所述的snp位点或所述的kasp分子标记在谷子育种中的应用，所述育种优选包括筛选高叶酸谷子。本发明所述snp位点与谷子叶酸具有显著的相关性，利用所述的snp位点的kasp分子标记可对材料的基因型进行检测，其结果几乎不受环境影响，实验结果稳定可靠。
31.本发明还提供了一种鉴别谷子叶酸性状的方法，包括如下步骤：
32.利用所述引物组对谷子基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
33.对所述扩增产物进行kasp基因分型检测，根据分型检测结果鉴别谷子叶酸性状；
34.所述谷子叶酸性状判定的方法为：当扩增产物的荧光信号为红色时，鉴定谷子叶酸性状为高叶酸；当扩增产物的荧光信号为蓝色时，鉴定谷子叶酸性状为非高叶酸。
35.本发明首先提取待测谷子基因组dna。本发明对所述待测谷子的种类没有特殊要求，任何种类的谷子均可。本发明对所述待测谷子基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的植物细胞基因组提取方法即可。在本发明具体实施过程中，以待测谷子新鲜叶片为材料，利用ctab法进行提取。
36.得谷子基因组dna后，本发明以待测谷子基因组dna为模板，利用所述引物组进行pcr扩增反应获得扩增产物。本发明中所述pcr扩增反应使用的反应体系以10μl计优选的包括：谷子基因组dna 2μl，引物组0.14μl，2x probe mixa溶液5μl和余量的ddh2o。本发明所述引物组中正向引物1、正向引物2和反向引物的体积比优选为2:2:5。本发明所述2x probe mixa溶液购买自high genotyping。本发明所述谷子基因组dna的浓度优选为50～100ng/μl，进一步优选为60～80ng/μl，更优选为65～70ng/μl；所述基因组dna的od
260
/od
280
比值优选为1.7～2.0。
37.本发明所述pcr扩增反应的程序优选为：
38.第一阶段：95℃预变性10min；
39.第二阶段：95℃变性20s，61℃退火40s，共10个循环；
40.第三阶段：95℃变性20s，55℃退火40s，共31个循环；
41.第四阶段：25℃保持10min。
42.本发明在所述pcr扩增完成后，优选的将pcr扩增产物保存于4℃。本发明所述pcr扩增反应结束后，所述pcr扩增产物中含有目标snps位点所在的dna片段。
43.得pcr扩增产物后，本发明对所述pcr扩增产物进行kasp基因分型检测，确定所述snp位点的基因型，根据分型检测结果鉴别谷子叶酸性状。本发明所述检测优选采用taqman genotyper software软件进行分析。本发明优选获取pcr扩增产物的hex和fam对应的相对荧光值，根据相对荧光值进行聚类分簇，根据样品簇确定基因型，具体的，当扩增产物的荧
光信号为红色时，鉴定谷子叶酸性状为高叶酸，对应的基因型为cc；当扩增产物的荧光信号为蓝色时，鉴定谷子叶酸性状非高叶酸纯合，即tt；当扩增产物的荧光信号为绿色时，鉴定谷子叶酸性状非高叶酸杂合，即ct。
44.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
45.实施例1
46.一种利用kasp技术检测谷子siadcl1基因并预测谷子叶酸的方法
47.1、实验材料
48.随机选取167份siadcl1优异等位变异位点上不同基因型的谷子材料(96份非高叶酸材料，71份高叶酸含量材料)为检测对象。
49.2、基因组dna的提取
50.(1)对实验材料进行育苗，取新鲜叶片于液氮中速冻，并将获得的材料保存于-80℃冰箱中用于提取dna；
51.(2)利用ctab法进行提取dna，得基因组dna，od
260
/od
280
比值须在1.7～2.0之间。
52.3、kasp技术进行基因分型
53.针对谷子siadcl1基因第1号外显子上第164bp位点(ncbi登录号为xp_004952187)设计引物组，对步骤2得到的基因组dna进行pcr扩增：
54.pcr扩增引物的5
’‑3’
核苷酸序列如下：
55.正向引物1(seq id no.3)：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctccgtggctgccctgacca-3’，正向引物15’末端用激发荧光基团fam标记；
56.正向引物2(seq id no.4)：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattccgtggctgccctgaccg-3’，正向引物15’末端用激发荧光基团hex标记；
57.反向引物(seq id no.5)：5
’‑
gaccttgctgccgtcgatt-3’；
58.上述引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
59.kasp检测流程如下：
60.1)提取待测谷子的基因组dna；
61.2)以待测谷子的基因组dna为模板，利用上述正向引物1、正向引物2和反向引物进行pcr扩增反应，得pcr扩增产物；
62.3)分析pcr扩增产物，从而对谷子siadcl1基因型进行判定。
63.其中，pcr扩增反应使用的反应体系以10μl计为：4-50ng/μl基因组dna2μl、引物mix 0.14μl(由6μl正向引物1+6μl正向引物2+15μl反向引物+23μlddh2o混合配制得到引物mix)、2x probe mix a溶液5μl和ddh2o 3μl；
64.pcr扩增反应的扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃退火40s，10个循环；95℃变性20s，55℃退火40s，31个循环；25℃保持10min；4℃保存。
65.扩增结束后，基于aqp基因分型系统操作说明(北京嘉诚生物科技有限公司aqp基因分析操作系统操作使用说明，(版本号v01/2021))进行kasp检测，设定abi7500 qpcr仪上pcr程序为35℃保持30s；导出结果文件，进一步根据样品簇确定基因型在taqman genotyper software软件上进行结果分析，获取每一个pcr反应孔的hex和fam对应的荧光值除以该孔参比染料(rox)的值，将数据荧光值进行标准化处理，得到每一个pcr反应孔的
hex和fam对应的相对荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)。根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇。检测结果如图1所示。
66.由图1可看出该位点有三种基因型，蓝色点代表基因型为t/t，红色点代表基因型为c/c，绿色点代表基因型为c/t。
67.测试例1
68.分析实施例1检测的谷子材料叶酸性状与分型结果的吻合度，谷子材料叶酸性状与分型结果对应情况以及吻合度如表1～2和图2所示。
69.表1籽粒表型性状与分型结果对应情况
70.71.72.[0073][0074]
注：图中h表示高叶酸；l表示非高叶酸。
[0075]
表2实施例1 kasp基因分型与表型统计结果
[0076][0077]
注：吻合度＝(kasp实验结果与实际材料性状相符合的材料数)/(总材料数)。
[0078]
根据表1～2和图2记载的内容可以看出，当扩增产物的荧光信号为红色时，鉴定谷子叶酸性状为高叶酸，对应的基因型为cc；当扩增产物的荧光信号为蓝色时，鉴定谷子叶酸性状非高叶酸纯合，即tt；当扩增产物的荧光信号为绿色时，鉴定谷子叶酸性状非高叶酸杂合，即ct。实施例1的kasp实验结果与待测样品的实际叶酸性状相近，检测到90份t/t的材料
(蓝色点)，50份c/c的材料(红色点)，27份数tc的材料(绿色点)，其中高叶酸性状与检测材料的实际性状吻合度达70.4％，非高叶酸性状与检测材料的实际性状吻合度达100％，kasp实验结果与测序结果(即测序结果为t/t)的吻合度为93.75％。总体来说，在146份待检测样品中，kasp检测结果与性状吻合度为87.43％，kasp检测结果与测序结果吻合度达83.8％。说明利用该分子标记对待测材料进行kasp实验，能够有效检测其基因型，从而完成种质的鉴定。
[0079]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。