一种提高干细胞细胞因子产量的方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高干细胞细胞因子产量的方法。


背景技术：

2.目前，皮肤组织的损伤常由机械性、物理性、化学性和生物性等因素引起，机体对形成的损伤进行修补的过程称为组织修复。组织修复还是一系列不同类型的修复细胞、结构蛋白和生长因子等形成网络式交互作用的结果。研究表明干细胞能够具有皮肤组织修复功能，表皮的自我更新能力主要取决于表皮基底层的干细胞，而表皮干细胞(esc)的增殖主要取决于皮肤成纤维细胞分泌的生长因子。脂肪干细胞也是常用的皮肤修复用细胞，其是另一种被广泛应用的多能干细胞。目前提高干细胞细胞因子产量的方法虽然已有研究，但是用于大规模使用的方法还不多，应用场景也不充分，需要进一步的提高。
3.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的用于大规模使用的提高干细胞细胞因子产量的方法还不多，应用场景也不充分，需进一步提高。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高干细胞细胞因子产量的方法。
5.本发明是这样实现的，一种提高干细胞细胞因子产量的方法，所述提高干细胞细胞因子产量的方法包括以下步骤：
6.步骤一，进行干细胞的培养：将脂肪干细胞接种于含有脂肪干细胞无血清完全培养基的t25培养瓶进行培养，待细胞浓度融合后，洗涤，再加入dmem-hg/f12培养基和胎牛血清完全培养基继续进行培养；
7.步骤二，进行细胞培养上清液的获取：当干细胞融合度达到75～85％时，对细胞培养液用氙灯进行照射，再次进行培养，收集干细胞因子的上清液；
8.步骤三，进行细胞培养上清液的预处理：将获取的干细胞因子的上清液用滤膜过滤后，依次通过50kd超滤膜和1kd超滤膜，得到细胞因子浓缩液；
9.步骤四，进行高产干细胞细胞因子的制备：向所述细胞因子浓缩液中加入冻干保护剂后进行冻干处理，得到包含有含量增多的干细胞因子冻干粉。
10.进一步，所述步骤一中的干细胞的培养方法包括：
11.(1)取脂肪干细胞，并将所述脂肪干细胞接种于t25培养瓶中；
12.(2)向所述t25培养瓶中加入脂肪干细胞无血清完全培养基进行培养；
13.(3)待细胞浓度融合至80％后，吸弃原来的培养基，用pbs洗涤2～3次后，再加入dmem-hg/f12培养基和胎牛血清完全培养基继续进行培养。
14.进一步，所述培养条件为37℃、5～10％co2、3～5％o2，培养24～48h。
15.进一步，所述dmem-hg/f12培养基为终浓度70ng/ml多肽的dmem-hg/f12培养基。
16.进一步，所述步骤二中的细胞培养上清液的获取方法包括：
17.(1)当干细胞融合度达到75～85％时，对细胞培养液用氙灯进行照射；
18.(3)氙灯照射后，再次放入培养箱中进行培养1～3h；
19.(3)循环培养3～5次后，收集包含有含量增多的干细胞因子的上清液。
20.进一步，所述氙灯照射照度为30000～60000lx，每次照射时间为2～4h。
21.进一步，所述步骤三中的细胞培养上清液的预处理方法包括：
22.(1)将获取的所述包含有含量增多的干细胞因子的上清液用滤膜过滤；
23.(2)用滤膜过滤后，将上清液通过50kd超滤膜，收集透析液；
24.(3)将所述透析液通过1kd超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液。
25.进一步，所述滤膜的直径为0.22μm。
26.进一步，所述步骤四中的高产干细胞细胞因子的制备方法包括：
27.(1)获取细胞因子浓缩液；
28.(2)向所述细胞因子浓缩液中加入0.1～0.5倍质量份数的冻干保护剂；
29.(3)将含冻干保护剂的细胞因子浓缩液进行冻干处理，得到包含有含量增多的干细胞因子冻干粉。
30.进一步，所述冻干保护剂按照质量份数计，由抗坏血酸30～50份、人白蛋白20～30份、甘氨酸15～20份、精氨酸10～15份、柠檬酸钠5～10份以及余量灭菌去离子水组成。
31.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的提高干细胞细胞因子产量的方法简单高效，使用氙灯照射培养提高了干细胞因子的总产量；将细胞因子冻干单独保存，为干细胞因子提供生存环境，维持干细胞因子活性。另外，本发明将制备的含有细胞因子的上清液的活性成分为人干细胞因子，对糖尿病皮肤创伤修复就有很好的愈合作用，应用范围广泛。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
33.图1是本发明实施例提供的提高干细胞细胞因子产量的方法流程图。
34.图2是本发明实施例提供的干细胞的培养方法流程图。
35.图3是本发明实施例提供的细胞培养上清液的获取方法流程图。
36.图4是本发明实施例提供的细胞培养上清液的预处理方法流程图。
37.图5是本发明实施例提供的高产干细胞细胞因子的制备方法流程图。
具体实施方式
38.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
39.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种提高干细胞细胞因子产量的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
40.如图1所示，本发明实施例提供的提高干细胞细胞因子产量的方法包括以下步骤：
41.s101，进行干细胞的培养：将脂肪干细胞接种于含有脂肪干细胞无血清完全培养基的t25培养瓶进行培养，待细胞浓度融合后，洗涤，再加入dmem-hg/f12培养基和胎牛血清完全培养基继续进行培养；
42.s102，进行细胞培养上清液的获取：当干细胞融合度达到75～85％时，对细胞培养液用氙灯进行照射，再次进行培养，收集干细胞因子的上清液；
43.s103，进行细胞培养上清液的预处理：将获取的干细胞因子的上清液用滤膜过滤后，依次通过50kd超滤膜和1kd超滤膜，得到细胞因子浓缩液；
44.s104，进行高产干细胞细胞因子的制备：向所述细胞因子浓缩液中加入冻干保护剂后进行冻干处理，得到包含有含量增多的干细胞因子冻干粉。
45.如图2所示，本发明实施例提供的步骤s101中的干细胞的培养方法包括：
46.s201，取脂肪干细胞，并将所述脂肪干细胞接种于t25培养瓶中；
47.s202，向所述t25培养瓶中加入脂肪干细胞无血清完全培养基进行培养；
48.s203，待细胞浓度融合至80％后，吸弃原来的培养基，用pbs洗涤2～3次后，再加入dmem-hg/f12培养基和胎牛血清完全培养基继续进行培养。
49.本发明实施例提供的培养条件为37℃、5～10％co2、3～5％o2，培养24～48h。
50.本发明实施例提供的dmem-hg/f12培养基为终浓度70ng/ml多肽的dmem-hg/f12培养基。
51.如图3示，本发明实施例提供的步骤s102中的细胞培养上清液的获取方法，包括：
52.s301，当干细胞融合度达到75～85％时，对细胞培养液用氙灯进行照射；
53.s302，氙灯照射后，再次放入培养箱中进行培养1～3h；
54.s303，循环培养3～5次后，收集包含有含量增多的干细胞因子的上清液。
55.本发明实施例提供的氙灯照射照度为30000～60000lx，每次照射时间为2～4h。
56.如图4所示，本发明实施例提供的步骤s103中的细胞培养上清液的预处理方法包括：
57.s401，将获取的所述包含有含量增多的干细胞因子的上清液用滤膜过滤；
58.s402，用滤膜过滤后，将上清液通过50kd超滤膜，收集透析液；
59.s403，将所述透析液通过1kd超滤膜，收集截留液，得到细胞因子浓缩液。
60.本发明实施例提供的滤膜的直径为0.22μm。
61.如图5所示，本发明实施例提供的步骤s104中的高产干细胞细胞因子的制备方法包括：
62.s501，获取细胞因子浓缩液；
63.s502，向所述细胞因子浓缩液中加入0.1～0.5倍质量份数的冻干保护剂；
64.s503，将含冻干保护剂的细胞因子浓缩液进行冻干处理，得到包含有含量增多的干细胞因子冻干粉。
65.本发明实施例提供的冻干保护剂按照质量份数计，由抗坏血酸30～50份、人白蛋白20～30份、甘氨酸15～20份、精氨酸10～15份、柠檬酸钠5～10份以及余量灭菌去离子水组成。
66.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所
作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。