一种鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的方法及其专用SNP引物组合

一种鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的方法及其专用snp引物组合
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的方法及其专用snp引物组合。


背景技术：

2.甜瓜(cucumis melo l.)为葫芦科甜瓜属一年生草本植物，果实营养丰富，是一种色、香、味俱佳的世界性水果。我国是甜瓜重要起源地之一，也是世界上生产和出口量最大的国家。国内育种家通常将甜瓜品种分为厚皮甜瓜和薄皮甜瓜：厚皮甜瓜果大肉厚、香甜可口，是高档的水果之一；薄皮甜瓜因脆嫩多汁或面而少汁，皮瓤均可食用，深受广大消费者喜爱。
3.由于薄皮甜瓜和厚皮甜瓜的栽培环境和商业用途有很大的区别，因此在农业生产和品种选育过程中必须明确甜瓜的种群属性。然而，随着薄皮甜瓜与厚皮甜瓜两种类型之间不断的杂交选育和基因交流，已不能简单通过比较种子大小来区分薄皮和厚皮甜瓜。据统计，我国申请登记的甜瓜品种已超过2000份，传统的田间表型鉴定费时费力，也不能满足当前数量激增的鉴定需求。因此，必须尽快建立一种简单快速区分薄皮甜瓜和厚皮甜瓜品种的方法，为甜瓜品种选育和种群鉴定提供技术支持。
4.snp作为第三代分子标记，其在基因组中分布广泛，平均每1000bp就会存在一个snp，遗传稳定且易于自动化检测。kasp(kompetitive allele specific pcr)，即竞争性等位基因特异性pcr技术，是用于snp分型的常用方法，具有高稳定性、准确性和低成本的特点，已被广泛应用于高通量分子辅助育种和品种鉴定。


技术实现要素：

5.本发明的目的是鉴定甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜。
6.本发明首先保护snp引物组合，可包括用于扩增甜瓜基因组的snp05位点的引物组1和/或用于扩增甜瓜基因组的snp28位点的引物组2；
7.snp05位点为1号染色体上的第33254142位核苷酸；
8.snp28位点为11号染色体上的第25077228位核苷酸；
9.snp05位点和snp28位点在染色体上的位置是基于甜瓜dhl92参考基因组序列比对确定的，甜瓜dhl92参考基因组序列的版本号为v3.5.1。
10.所述snp引物组合中，所述引物组1可由seq id no：1所示的正向引物1f1、seq id no：2所示的正向引物1f2和seq id no：3所示的反向引物1r组成。所述引物组2可由seq id no：4所示的正向引物2f1、seq id no：5所示的正向引物2f2和seq id no：6所示的反向引物2r组成。
11.所述snp引物组合中，所述引物组1可由seq id no：1自5’末端起第22至43位所示的正向引物1f1、seq id no：2自5’末端起第22至44位所示的正向引物1f2和seq id no：3所
示的反向引物1r组成。所述引物组2可由seq id no：4自5’末端起第22至41位所示的正向引物2f1、seq id no：5自5’末端起第22至42位所示的正向引物2f2和seq id no：6所示的反向引物2r组成。
12.上述任一所述引物组中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的摩尔比具体可为2:2:5。
13.上述任一所述snp引物组合可由所述引物组1和/或所述引物组2组成。
14.上文中，序列表中序列1自5
′
末端起第1至21位所示的核苷酸序列为荧光标签序列(即fam荧光标签序列)，荧光信号具体为蓝色。序列表中序列2自5
′
末端起第1至21位所示的核苷酸序列也为荧光标签序列(即hex荧光标签序列)，荧光信号具体为红色。
15.含有上述任一所述snp引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。
16.所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将上述任一所述引物组中的各条引物分别单独包装的步骤。
17.所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的应用可为鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜。
18.上述任一所述的snp引物组合在制备用于鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
19.上述任一所述的snp引物组合在鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜中的应用也属于本发明的保护范围。
20.本发明还保护一种鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的方法，包括如下步骤：检测待测甜瓜品种基于snp05位点和/或snp28位点的基因型，然后进行如下判断：如果基于snp05位点的基因型为tt纯合型和/或基于snp28位点的基因型为cc纯合型，则待测甜瓜品种鉴定为或疑似鉴定为薄皮甜瓜；如果基于snp05位点的基因型为gg纯合型和/或基于snp28位点的基因型为aa纯合型，则待测甜瓜品种鉴定为或疑似鉴定为厚皮甜瓜；
21.snp05位点为1号染色体上的第33254142位核苷酸；
22.snp28位点为11号染色体上的第25077228位核苷酸；
23.snp05位点和snp28位点在染色体上的位置是基于甜瓜dhl92参考基因组序列比对确定的，甜瓜dhl92参考基因组序列的版本号为v3.5.1。
24.上述方法中，所述检测待测甜瓜品种基于snp05位点和/或snp28位点的基因型的步骤可如下：
25.(1)以待测甜瓜品种的基因组dna为模板，采用上述任一所述引物组1和/或上述任一引物组2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
26.(2)完成步骤(1)后，采用仪器检测pcr扩增产物的荧光信号，根据荧光信号的颜色获得待测甜瓜品种基于snp05位点和/或snp28位点的基因型。
27.上述方法中，所述检测待测甜瓜品种基于snp05位点和/或snp28位点的基因型的步骤如下：
28.(1)以待测甜瓜品种的基因组dna为模板，采用上述任一所述引物组1和/或上述任一所述引物组2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
29.(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物，测序；
30.(3)根据步骤(2)得到的测序结果，获得待测甜瓜品种基于snp05位点和/或snp28
位点的基因型。
31.上述任一所述的方法中，“采用上述任一所述引物组1和/或上述任一引物组2进行pcr扩增”的反应程序具体可为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
32.随着基因组学技术的发展，甜瓜基因组已公布并完成1000多份甜瓜资源的全基因组重测序，丰富的变异组大数据为筛选甜瓜种群特异的遗传位点提供了标记资源。利用薄皮甜瓜和厚皮甜瓜的种质资源的重测序数据，从全基因组筛选种群特异的遗传位点，进而开发用于鉴定薄皮甜瓜和厚皮甜瓜的snp引物组合。本发明提供的snp引物组合可用于鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜，对农业生产和品种选育过程中明确甜瓜的种群属性具有重要的应用价值。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。
附图说明
33.图1为111份甜瓜代表资源重测序数据的pca聚类结果。
34.图2为采用引物组1鉴定供试甜瓜品种的部分snp分型结果。
35.图3为采用引物组2鉴定供试甜瓜品种的部分snp分型结果。
36.图4为采用引物组1鉴定待测甜瓜品种的部分snp分型结果。
37.图5为采用引物组2鉴定待测甜瓜品种的部分snp分型结果。
具体实施方式
38.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
39.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
40.实施例1、用于鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的snp引物组合的获得
41.一、31个snp位点的发现
42.本发明基于111份甜瓜代表资源的重测序数据，筛选snp两翼50bp无其它变异且基因组特异的perfect snp位点，最终获得31个snp位点。这111份甜瓜代表资源代表了广泛的甜瓜遗传多样性，包括57份厚皮甜瓜和54份薄皮甜瓜。111份甜瓜代表资源重测序数据的pca聚类结果见图1。
43.具体的，snp位点的筛选标准如下：首先在全基因组内选择maf》0.3、杂合度小于0.1、缺失率小于0.1且两翼50bp序列保守(无indel，无ssr，无其它snp)的snp位点，共获得11498个甜瓜perfect snp；之后，筛选非同义snp用于计算薄皮甜瓜与厚皮甜瓜之间的snp变异频率，最终获得在两个种群之间的snp频率差值为1的snp位点共计31个。
44.31个snp位点的基本信息详见表1(薄皮甜瓜对应的种质资源为agrestis，厚皮甜
瓜对应的种质资源为melo)。其中snp位点在染色体上的位置是基于甜瓜dhl92参考基因组序列比对确定的，甜瓜dhl92参考基因组序列的版本号为v3.5.1(下载地址为：http://cucurbitgenomics.org/ftp/genome/melon/v3.5.1/)。
45.表1. 31个snp位点的基本信息
[0046][0047][0048]
二、用于鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的snp引物组合的获得
[0049]
基于步骤一发现的31个snp位点，本发明的发明人设计并合成了31个snp引物组合并对已知薄皮甜瓜或厚皮甜瓜的24个甜瓜品种进行snp分型。根据snp基因型结果，获得2个纯合基因型比例较高且与薄皮甜瓜或厚皮甜瓜具有100％连锁的snp位点，即snp05和snp28。
[0050]
snp引物组合由引物组1和/或引物组2组成。用于扩增snp05的引物组为引物组1。
用于扩增snp28的引物组为引物组2。每个引物组由3条引物序列组成，用于扩增一个snp位点。引物组1和引物组2中各个引物的核苷酸序列如表2中第4列所示。
[0051]
表2.用于鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的snp引物组合
[0052][0053][0054]
注：单下划线为fam荧光标签序列，双下划线为hex荧光标签序列。
[0055]
实施例2、实施例1开发的snp引物组合的有效性检验
[0056]
本实施例中的144个供试甜瓜品种的基本信息见表3中第1至4列。144个供试甜瓜品种均为常见的市场品种。根据表型，39个供试甜瓜品种为薄皮甜瓜，105个供试甜瓜品种为厚皮甜瓜。
[0057]
表3. 144个供试甜瓜品种的基本信息
[0058]
[0059]
[0060]
[0061][0062]
1、供试甜瓜品种的基因组dna的获得
[0063]
采用ctab法分别提取144个供试甜瓜品种的幼根(混取10粒种子的幼根)的基因组dna，得到供试甜瓜品种的基因组dna。
[0064]
供试甜瓜品种的基因组dna的质量和浓度均须满足pcr要求，达标标准为：琼脂糖电泳显示dna条带单一，没有明显弥散；紫外分光光度计nanodrop2000(thermo)检测a260/a280比值在1.8左右，a260/a230比值大于1.8；供试甜瓜品种的基因组dna的浓度在10-30ng/μl。
[0065]
2、分别以144个供试甜瓜品种的基因组dna为模板，采用引物组1或引物组2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。各个pcr反应体系中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的浓度比为2:2:5。
[0066]
反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。
[0067]
3、完成步骤2后，待各个pcr扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，根据荧光信号颜色判断144个供试甜瓜品种基于每个snp位点的基因型。具体的判断原则如下：如果某供试甜瓜品种基于某snp位点显示蓝色荧光信号，则该供试甜瓜品种基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点且名称中含有“f1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试甜瓜品种基于某snp位点显示红色荧光信号，则该供试甜瓜品种基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点且名称中含有“f2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果某供试甜瓜品种基于某snp位点显示绿色荧光信号，则该供试甜瓜品种基于该snp位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该snp位点且名称中含有“f1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该snp位点且名称中含有“f2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”。
[0068]
需要说明的是，若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
[0069]
引物组1的部分snp分型结果见图2。统计结果见表3中第5列。
[0070]
引物组2的部分snp分型结果见图3。统计结果见表3中第6列。
[0071]
结果表明，引物组1和引物组2在144个供试甜瓜品种中均可以得到很好的分型效果。
[0072]
4、采用引物组1或引物组2鉴定144个供试甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的效率评价
[0073]
(1)统计144个供试甜瓜品种基于snp05位点的基因型。
[0074]
结果表明，基于snp05位点的基因型为tt纯合型的供试甜瓜品种为39个，判定为薄皮甜瓜，这39个甜瓜的表型全部为薄皮甜瓜，一致性为100％；基于snp05位点的基因型为gg纯合型的供试甜瓜品种为97个，判定为厚皮甜瓜，这97个甜瓜的表型全部为厚皮甜瓜，一致性为100％。
[0075]
(2)统计144个供试甜瓜品种基于snp28位点的基因型。
[0076]
结果表明，基于snp28位点的基因型为cc纯合型的供试甜瓜品种为39个，判定为薄皮甜瓜，这39个甜瓜的表型全部为薄皮甜瓜，一致性为100％；基于snp28位点的基因型为aa纯合型的供试甜瓜品种为97个，判定为厚皮甜瓜，这97个甜瓜的表型全部为厚皮甜瓜，一致性为100％。
[0077]
由此可见，实施例1开发的snp引物组合可以鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜。
[0078]
实施例3、采用实施例1开发的snp引物组合鉴定待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜的准确性
[0079]
待测甜瓜品种分别为待测甜瓜品种1—待测甜瓜品种48，共计48个。
[0080]
1、采用实施例1开发的snp引物组合鉴定每个待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜。具体步骤如下：
[0081]
(1)种植待测甜瓜品种的种子，得到待测甜瓜幼苗；取待测甜瓜幼苗的叶片或根，采用ctab法分别提取基因组dna，获得待测甜瓜品种的基因组dna。
[0082]
(2)以待测甜瓜品种的基因组dna为模板，采用引物组1或引物组2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。各个pcr反应体系中，名称中含有“f1”的引物、名称中含有“f2”的引物和名称中含有“r”的引物的浓度比为2:2:5。
[0083]
反应程序为：94℃预变性，15min；94℃变性20s，61℃-55℃(选用touch down程序，每循环降低0.6℃)，1min，扩增10个循环；94℃变性20s，55℃复性&延伸1min，继续扩增26个循环。
[0084]
(3)完成步骤(2)后，待各个pcr扩增产物温度降至40℃以下时通过酶标仪的fam、hex光束扫描读取荧光值(fam荧光标签序列在激发光485nm，发射光520nm波长下观察读值，hex荧光标签序列在激发光528nm，发射光560nm波长下观察读值)，得到荧光信号颜色，进行如下判断：如果待测甜瓜品种基于某snp位点显示蓝色荧光信号，则该待测甜瓜品种基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点且名称中含有“f1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果待测甜瓜品种基于某snp位点显示红色荧光信号，则该待测甜瓜品种基于该snp位点的基因型为“扩增该snp位点且名称中含有“f2”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”纯合型；如果待测甜瓜品种基于某snp位点显示绿色荧光信号，则该待测甜瓜品种基于该snp位点的基因型为杂合型，一个碱基为“扩增该snp位点且名称中含有“f1”的引物的3’末端第1个碱基的互补碱基”，另一个碱基“扩增该snp位点且名称中含有“f2”的引物
的3’末端第1个碱基的互补碱基”。
[0085]
需要说明的是，若pcr扩增结束后荧光信号弱，影响数据分析，可以加循环(94℃变性20s，55℃复性及延伸1min，5个循环)，直至结果满意为止。
[0086]
引物组1的部分snp分型结果见图4和表4中第2列。
[0087]
引物组2的部分snp分型结果见图5和表4中第3列。
[0088]
(4)完成步骤(3)后，进行如下判断：如果基于snp05位点的基因型为tt纯合型和/或基于snp28位点的基因型为cc纯合型，则鉴定为薄皮甜瓜；如果基于snp05位点的基因型为gg纯合型和/或基于snp28位点的基因型为aa纯合型，则鉴定为厚皮甜瓜。
[0089]
表4
[0090]
[0091][0092]
2、分别种植48个待测甜瓜品种。根据表型，判断48个待测甜瓜品种为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜。
[0093]
表型统计结果见见表4中第4列。
[0094]
结果表明，实施例1开发的snp引物组合的鉴定结果与表型鉴定结果完全一致。
[0095]
由此可见，采用实施例1开发的snp引物组合完全可以鉴定甜瓜为薄皮甜瓜还是厚皮甜瓜。
[0096]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。