一种厨余垃圾腐熟降解菌剂及其应用

1.本发明属于微生物领域，涉及一种厨余垃圾腐熟降解混合菌菌剂及其应用。


背景技术：

2.餐厨垃圾是指家庭、饭店以及各种餐饮机构抛弃的剩菜剩饭的统称。目前，厨余垃圾的处理方式主要有焚烧、填埋、粉碎直排、肥料制作。其中,肥料制作是厨余垃圾资源化利用的主要方式之一。而好氧堆肥又是肥料化处理厨余垃圾的主要方法。由于厨余垃圾含有大量纤维素，而纤维素具有复杂的分子结构，很难被自然降解，制约了堆肥腐熟的周期。研究显示，通过在堆肥中添加纤维素降解菌可以有效缩短堆肥腐熟的周期。李雯等通过在玉米秸秆中加入纤维素降解菌使堆肥腐熟时间缩短3-5天。吴庆珊等从羊粪中筛选出纤维素降解菌，将其加入羊粪中，缩短了堆肥腐熟周期。但是目前能高效降解餐厨垃圾中纤维素、油脂等难有机物腐熟降解菌较少。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供厨余垃圾腐熟降解菌剂及其应用，能够降解厨余垃圾堆肥中的纤维素、油脂等难有机物，促进厨余垃圾快速腐熟，为餐厨垃圾资源化利用提供技术支持和理论依据。
4.本发明提供的技术方案如下：
5.一种厨余垃圾腐熟降解菌剂，包括枯草芽孢杆菌y1(bacillus subtilis)和贝莱斯芽孢杆菌y3(bacillus velezensis)，所述枯草芽孢杆菌y1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年2月28日，保藏号为cgmcc no.24449；所述贝莱斯芽孢杆菌y3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年2月28日，保藏号为cgmcc no.24450。
6.进一步的，所述枯草芽孢杆菌y1和贝莱斯芽孢杆菌y3的菌落数比例为2:1。
7.本发明还提供上述厨余垃圾腐熟降解菌剂的制备方法，所述枯草芽孢杆菌y1和贝莱斯芽孢杆菌y3通过y1:y3＝2:1的比例，接种量(v/w即混合菌液与厨余垃圾质量比)为10～20％、转速为120～160r/min、ph为7～8、发酵温度为30℃的条件下混合，得到厨余垃圾腐熟降解菌剂。
8.进一步的，接种量为13.5％、转速为132r/min、ph为7.6。
9.本发明还提供一种厨余垃圾腐熟降解方法，将权利要求1所述的厨余垃圾腐熟降解菌剂与厨余垃圾混合并进行好氧发酵。
10.进一步的，加菌量为200g/t，转速为12r/min。
11.进一步的，起始温度为60℃。
12.进一步的，发酵时间为16h。
13.本发明还提供一种厨余垃圾腐熟降解菌，分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2022年2
1.25g,fecl
3 0.005g,cacl
2 0.05g，蒸馏水500ml,ph 7.2左右；
36.秸秆平板粉培养基：琼脂粉9g，小麦秸秆粉5g，赫奇逊氏无机盐培养液500ml；
37.秸秆产酶培养基：水稻秸秆粉10g，赫奇逊氏无机盐培养液500ml。
38.滤纸崩解培养基：1cm
×
6cm的滤纸条三条，kh2po
4 0.1g，mgso4·
7h2o 0.04g，(nh4)2so
4 0.3g，酵母粉0.01g，蒸馏水100ml。
39.lb培养基：胰蛋白胨5g，nacl 5g,酵母浸膏2.5g，蒸馏水500ml，ph 7.2。
40.以上培养基都在120℃下高温灭菌30min。
41.(二)菌株的筛选分离与纯化
42.取10g低温保存的堆肥于90ml的无菌水中，放在(30℃，200r/min)的恒温震荡箱中震荡30min，取下后静置10min，取悬浮液1ml，用无菌水稀释成10-1
、10-2
、10-3
、10-4
和10-5
五个梯度浓度，吸取100μl10-5
梯度的稀释液，涂布于以秸秆为唯一碳源的秸秆平板培养基中。将培养基放在30℃的恒温培养箱中培养五天，选取菌落直径较大的五株菌株进行分离与纯化，采用划线法纯化单菌落。将纯化好的菌株涂布在斜面培养基中，置于30℃恒温培养箱中培养一天，取出后放在4℃冰箱中保存备用。
43.将纯化好的五株菌株分别接种在羧甲基纤维素钠培养基上，置于恒温培养箱(30℃)中培养五天，用1g/l的刚果红溶液染色20min后弃去染液，再用1mol/l的氯化钠溶液洗涤30min，根据透明圈直径(h)与菌落直径(d)的比值初筛出产纤维素酶能力较强的菌株，即纤维素降解菌株y1与y3，其h/d比值分别达到4.4和3.8，如图1和2所示。
44.两个菌株菌落形态相近：近似圆形，白色、不透明、边缘较平整、表面光滑、中间凸起、易挑取。可在15-45℃，ph 5.0-10.0的范围内生长，最易生长ph为7。生长迅速，易分离培养。能分泌产生多种生物活性物质。包括酶、抗菌蛋白、脂肽类抗生素、聚酮类抗生素、植物激素等。
45.(三)秸秆降解实验
46.将筛选出产纤维素酶较强的菌株制成菌悬液，取10ml菌悬液转接至秸秆降解培养基中，在恒温震荡培养箱(30℃、160r/min)中培养十二天后取出秸秆。用蒸馏水反复冲洗五次，80℃烘制恒重，每个处理做三个平行。秸秆的降解率按照减重法计算。
47.秸秆降解率(％)＝[原秸秆质量(g)-烘干秸秆质量(g)]/原秸秆质量(g)
×
100％
[0048]
通过计算得到，在连续十二天的秸秆降解实验中，接种了菌株y1的秸秆降解培养基中，秸秆的降解率达到了42.50％，接种了菌株y3的秸秆降解培养基中，秸秆的降解率达到了40.94％。
[0049]
(四)滤纸降解实验
[0050]
将筛选得到的菌株制成菌悬液，分别将5ml菌悬液转接至滤纸条崩解培养基中，置于恒温培养箱中(30℃，160r/min)培养十天，以未接种菌株的培养液做空白对照，观察滤纸的崩解情况。如图3和4所示，结果显示，加入菌株的培养基中滤纸被分解成近似糊状，而未接种菌株的培养液中滤纸基本没有变化。说明菌株对滤纸有很强的降解作用。
[0051]
(五)厨余垃圾腐熟降解实验
[0052]
将菌株y1和y3制成菌悬液，分别以1％、2％、3％、4％和5％的接种量与10kg厨余垃圾充分混合。以不加菌液的厨余垃圾做空白参照。每隔两天采一次样，测量样品的c/n，判断不同处理对堆肥腐熟程度的影响。
[0053]
实验结果表明，接种菌株的厨余垃圾腐熟时间明显少于空白对照，其中接种量为3％的厨余垃圾堆肥腐熟时间最短，为15天。未接种菌悬液的厨余垃圾腐熟时间高达45天，说明菌株均可以大大缩短厨余垃圾腐熟时间。
[0054]
二、纤维素酶活的测定
[0055]
(一)粗酶液的制备
[0056]
将菌株y1与y3分别制成菌悬液，取10ml菌悬液转接至液体产酶培养液中，在恒温培养箱(30℃，120r/min)中连续培养15天，每隔24h取培养液8-10ml，取出的培养液用0.45um的水系滤头过滤，过滤后得到的滤液即粗酶液。
[0057]
(二)酶活力的测定
[0058]
纤维素酶是多酶复合物，包含三种主要成分，即内切葡萄糖酶、外切葡萄糖酶和β-葡萄糖苷酶。酶活力定义为1ml原酶液每分钟催化底物产生相当于1ug对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位(u/ml)。通过连续十五天的菌株纤维素酶活性实验，如图5和6所示，可以发现，菌株y1与y3的三种纤维素酶活峰值都出现在第六天，这说明菌株y1和y3的三种纤维素酶具有很强的协同作用。同时两者有十分相近的理化性质，可以同时作为消解菌混合使用。y1的内切葡萄糖酶、外切葡萄糖酶和β-葡萄糖苷酶活峰值分别为25.63，21.54，18.41μmol/ml。y3的内切葡萄糖酶、外切葡萄糖酶和β-葡萄糖苷酶活峰值分别为20.53，23.65，8.94u/ml。
[0059]
三、纤维素降解菌株的鉴定
[0060]
参照《伯杰氏菌株鉴定手册(第8版)》、《常见细菌系统鉴定手册》和革兰氏染色法，对菌株进行形态学鉴定。
[0061]
提取细菌总dna，正向引物为27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3’，反向引物为1492r:5'-ggttacct tgttac gactt-3’。pcr反应体系为20μl，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共28个循环。pcr产物经纯化后送至上海凌恩生物科技有限公司进行测序。
[0062]
将测序得到的菌株的dna序列在ncbi中进行blast序列比较分析。用mega7.0构建菌株16s rdna系统发育树。
[0063]
四、菌株为新菌株
[0064]
将菌株测序得到的16s rdna序列提交到ncbi进行blast比对，利用mega7.o软件中的邻接法构建两株菌株的系统发育树。进化树构建时使用嗜碱甲烷杆菌(methanobacterium alcaliphilum，ab496639.1)作为外类群，其他近源物种的选择通过blast以及ncbi taxonomy数据库确定。从进化树来看，y1与y3均属于芽孢杆菌，y1与枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis yebn5，mt372156.1)进化距离最近，聚在同一支，因此菌株y1属于枯草芽孢杆菌，如图7所示。y3与贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis strain fzb42,nr 075005.2)进化距离最近，聚在同一支，结合y3菌株的形态特征，确定y3菌株为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，如图8所示。
[0065]
五、菌种混合比例优化
[0066]
(一)拮抗实验
[0067]
用接菌环分别从平板上挑取单个y1和y3菌落，通过画“井”字法，接种到同一个平板上，放在恒温培养箱内培养2天后，观察平板上菌落的生长情况。两种菌的交叉点上的细
菌正常生长，两种菌株无拮抗作用，可以共同培养。
[0068]
(二)单因素实验
[0069]
(1)接菌比例对两种芽孢杆菌的产量和比例的影响
[0070]
两种芽孢杆菌混合发酵时，两者之间存在着竞争关系，控制好两者的初始接菌量的比例有利于两种芽孢杆菌均衡生长。由图9可以看出，当两种初始细菌的比例为y1:y3＝2:1时，细菌的总量最大，菌数达峰值为4.36
×
106cfu/ml。
[0071]
(2)接菌量对两种芽孢杆菌的产量和比例的影响
[0072]
接菌量影响到菌落的生长，所以控制接菌量对两种菌株混合培养至关重要。如图10所示，菌数随着接种量的增加呈现先增加后减少的趋势，当接菌量为10％、20％时，两种芽孢杆菌数量的比值较大，菌体的数量较多，与1％和50％相比差异显著。因此，在混合发酵菌株y1和y3时，接菌量在10％～20％为最适生长条件。
[0073]
(3)ph对两种芽孢杆菌的产量和比例的影响
[0074]
微生物通过酸碱性来调节细胞的通透性，ph影响细胞的胞内蛋白结构和功能，如图11所示，当ph为9.0时两种细菌的比例达到最大值0.48，但是数量最少，与其他三组相比差异显著。初始ph为7.0和8.0时，两种芽孢杆菌菌株生长旺盛，数量较多，与其他两组相比差异显著。因此，在发酵混合菌株y1和y3时，初始ph值7.0～8.0为最适生长条件。
[0075]
(4)转速对两种芽孢杆菌的产量和比例的影响
[0076]
本实验混合培养的两种菌株y1和y3都是好氧型微生物，转速的高低对培养基内的溶氧量有显著的影响，所以控制好转速对混合培养有着重要意义。如图12所示，随着转速的提高细菌的数量先上升后下降，但是数量差异不显著。当转速为120r/min和160r/min时，两种细菌的比值最大，与其他几组相比差异明显。因此，在混合发酵菌株y1和y3时，转速在120～160r/min为最适生长条件。
[0077]
(5)温度对两种芽孢杆菌的产量和比例的影响
[0078]
温度不仅影响到微生物体内酶的活性，还影响微生物细胞蛋白质的表达。当温度为30℃时，细菌的数量和两种细菌的比例都达到最大值，且与其他组相比差异显著。此时菌体的数量达到峰值6.6
×
106cfu/ml，两种芽孢杆菌数量的比值0.52。因此，在混合发酵菌株y1和y3时最佳培养温度为30℃。
[0079]
(6)通过响应面优化培养条件
[0080]
通过响应面实验结果，对菌体浓度的二次多项式数学模型解逆矩阵得知，最优培养条件：接种量为13.5％、转速为132r/min、ph为7.6、最佳初始比例为y1:y3＝2:1、发酵温度为30℃。
[0081]
(7)对混合菌液进行秸秆降解实验
[0082]
表1混合菌降解效果对比
[0083][0084]
混合菌相比单菌株的秸秆降解率更高，滤纸崩解效果更好，有更好的纤维素降解能力。
[0085]
六、混合菌剂工艺应用优化
[0086]
将混合菌研制成水分散型混合菌剂(含菌量为2.52
×
108cfu/g)，并将该菌剂应用于日处理量5t的餐厨垃圾处理设备，同时对餐厨垃圾处理设备运行工艺采用了四因素三水平正交试验设计进行优化。四因素为菌剂量、时长、转速和起始温度，每个因素设置了三水平，具体见表2。
[0087]
表2正交试验因素水平情况表
[0088][0089]
表3正交试验设计表
[0090][0091]
表4正交试验极差分析
[0092]
[0093][0094]
如正交试验结果所示(表4)，随着加菌量的增加，c/n值先升高后降低，当加菌量在200g/t时达到最大。发酵时长在0-16h之间，c/n值越来越高，当到16h时c/n值达到最大，然后开始降低。当转速在12-15r/min时，c/n值持续降低，当到15r/min时c/n达到最低，随后开始缓慢上升，但整个过程仍低于转速在12r/min时的c/n值。当温度在50-60℃时，随着温度的升高，c/n值越来越大，当温度到达60℃时，c/n值最大，随后c/n开始缓慢降低。根据实验结果，当加菌量为200g/t、反应时长为16h、转速在12r/min、起始温度在60℃时，一次好氧发酵的条件最好，餐厨垃圾在此条件下能够快速发酵。
[0095]
菌株y1的拼接序列(seq id no.1)
[0096]
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[0097]
菌株y3的拼接序列(seq id no.2)
[0098]
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