NCOR2可变剪切体在制备预防或治疗马尔尼菲篮状菌感染的药物中的应用

ncor2可变剪切体在制备预防或治疗马尔尼菲篮状菌感染的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种ncor2可变剪切体在制备预防或治疗马尔 尼菲篮状菌感染的药物中的应用。


背景技术：

2.马尔尼菲篮状菌(talaromycesmarneffei，tm)感染是我国华南地区aids人群死亡的 重要原因之一。tm感染是一种区域高发性疾病，主要流行于中国南部和东盟各国的aids 人群。广西艾滋病患者合并tm感染的死亡风险居所有机会性感染之首(ahr＝4.51)，而 我国56.6％的tm病报告病例出现在广西。因此，tm感染是造成中国南部和东南亚沿线 国家艾滋病病人死亡的重要原因，已经成为当地一个严重的公共卫生问题，tm也被who 拟列入“重点真菌病原体清单”。
3.tm病高致死率的原因一方面在于早期诊断困难，而另一方面是由于临床抗真菌治疗 的效果并不理想。tm病病人若不进行治疗，病死率高达80％-100％，而及时进行抗真菌 治疗，病死率亦可高达30％。因此，优化治疗方案以降低病死率是当前亟待解决的临床问 题。有趣的是，既往研究发现斑马鱼胚胎的巨噬细胞能够保护tm免受中性粒细胞的杀伤。 由此可见，tm在人体内可能存在一套基于巨噬细胞的免疫逃逸策略。tm作为一种嗜巨 噬细胞性真菌，在入侵机体后绝大多数被巨噬细胞吞噬。巨噬细胞作为机体抵抗病原体入 侵的第一道防线，反而为tm提供躲避免疫杀伤的生态位，这类现象被《immuntiy》杂志 称为“巨噬细胞悖论”。实际上，不少病原体，如肺结核分支杆菌、白色念珠菌等，均存 在该现象。因此，弄清tm逃逸巨噬细胞杀伤的分子机制，找出针对性的治疗靶点和干预 措施，破解“巨噬细胞悖论”是当前的科学前沿问题，对治疗tm病病人、降低病死率具 有重要意义。
4.可变剪切(alternativesplicing，as)是一种普遍存在的基因表达调控机制，它允许单 个基因产生多种独特的mrna。既往研究发现大约90％-95％的基因都会经历一定程度的 as，而大约37％的基因能产生多种异型蛋白，而这些蛋白可能发挥着截然不同的生物学功 能，这说明as在蛋白质组的复杂性和功能多样性中发挥了重大作用。因此，探索as的 功能对于理解生命机制是至关重要的，然而目前仅多见于肿瘤研究中，真菌领域特别是tm 感染方面鲜有研究。
5.ncor2作为一种关键的bcl6共抑制因子，主要在nf-κb调节的炎症和组织重塑上 发挥作用。ncor2发生as事件可导致24种不同的转录本变异体及其编码可变剪切体， 其中功能较为明确的剪切体为分子量为274kda的ncor2或smrt蛋白(下称为smrt)。 smrt可通过招募tbl1、tblr1和hdac3形成核共抑制复合物，抑制转录因子(ap-1 等)的激活，从而抑制机体炎症因子的转录水平，起到抗炎作用。当机体受到外界刺激， 如损伤、病原体入侵等，smrt-tbl1-tblr1-hdac3复合体会被泛素化降解，从而解除 其对于炎症因子的转录抑制，机体产生大量炎症因子用于免疫反应。ncor2-013是ncor2 一个可变剪切体，分子量小，由156个氨基酸构成，仅为smrt蛋白的十六分之一。
6.随虽然现有技术中已经有对马尔尼菲篮状菌感染病有研究，如专利cn113140325a提 供了一种hiv患者马尔尼菲篮状菌病发病概率预测模型的建立方法，该预测模型是基于随 机森林算法的模型进行的，包括建立在hiv患者中预测马尔尼菲篮状菌病发病概率的随机 森林模型；测试并评估模型，剔除影响较小的自变量，得到优化的预测模型，为hiv患者 的马尔尼菲篮状菌病发病率预测提供了一种有效的方法。以及专利cn112255354b提供了 马尔尼菲篮状菌病诊断特征物及其筛选方法和应用，属于生物科学技术领域；所述马尔尼 菲篮状菌病诊断特征物包括甲醛、乙醛、2.5-二甲基苯甲醛和环己酮中的一种或几种。通 过对待检测患者的呼出气体中的马尔尼菲篮状菌病诊断特征物进行检测，能够准确诊断患 者患马尔尼菲篮状菌的情况，实现马尔尼菲篮状菌病的早期诊断等。纵观现研究中，都仅 是停留在对于tm感染病的防治，而对于利用tm感染可以诱导thp-1巨噬细胞ncor2 产生新的可变剪切体进行研究在马尔尼菲篮状菌感染中的应用是几乎没有的。
7.有鉴于此，本技术将在ncor2中产生的一种新的可变剪切体，分析该新可变剪切体 的亚细胞定位和生物学功能，并分析其在马尔尼菲篮状菌感染中的应用，为tm诊断治疗 提供新思路。


技术实现要素：

8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.一种ncor2可变剪切体，马尔尼菲篮状菌(tm)感染诱导thp-1巨噬细胞ncor2 产生可变剪切体ncor2-013，所述ncor2-013剪切体由四个外显子构成，分别为 ense00001612626、ense0000997027、ense0000997044、ense00001703068(均为5
’ꢀ
端到3’端)，其序列依次如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4 所示；其中蛋白序列如seq id no.5所示。
10.优选的，所述可变剪切体ncor2-013通过与tbl1xr1/tblr1-hdac3-junb结合形 成复合体。
11.优选的，可变剪切体ncor2-013作为药物靶点或者基因治疗中的靶基因用于筛选或 者制备tm感染及其他感染性疾病中的至少一种疫苗/药物/免疫佐剂。
12.优选的，所述疫苗/药物/免疫佐剂包括ncor2-013的抑制剂。
13.优选的，所述的ncor2-013抑制剂包括ncor2-013基因的sirna、ncor2-013基 因的rna干扰载体、ncor2-013基因的敲除载体、ncor2-013蛋白抗体及其他能够抑制 ncor2-013表达的抑制剂中的一种。
14.优选的，可变剪切体ncor2-013用于构建ncor2-013基因表达的体外细胞模型或者 动物模型。
15.产生的的技术效果：
16.1、本发明所述这一新的剪切体，通过tm感染可以诱导thp-1巨噬细胞ncor2产 生新的可变剪切体ncor2-013，为tm诊断治疗提供潜在的生物标志物。
17.2、基于ncor2-013在tm感染中发挥的作用，为研发防治tm感染的药物或疫苗提 供新靶标。
18.3、本发明通过实验得到了ncor2-013的新特性，即通过形成 ncor2-013-tbl1xr1-tblr1-hdac3-junb复合体通过抑制tnf-α和il-1β的转录，发 挥抗炎作用，促进tm的增殖和
感染。
19.上述说明仅是本技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本技术的技术手段，从而 可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本技术的上述和其他目的、特征和优点能够更 明显易懂，以下以本技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
20.根据下文结合附图对本技术具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本 申请的上述及其他目的、优点和特征。
附图说明
21.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技 术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本技术的一 些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这 些附图获得其他的附图。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。 附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
22.图1是测序筛选tm感染特异性的ncor2可变剪切体，其中，a为tm感染thp-1 巨噬细胞24h后ncor2每个转录本的表达热图；b为qpcr验证tm感染thp-1巨噬细 胞后，ncor2-013的表达情况；c.ncor2-013剪切体的结构示意图；
23.图2是构建和验证ncor2-013过表达的thp-1巨噬细胞，其中，a为qpcr验证thp-1 巨噬细胞ncor2-013过表达效率；b为wb验证thp-1巨噬细胞ncor2-013过表达效率；
24.图3是ncor2-013剪切体在thp-1巨噬细胞的定位，其中，a为ncor2-013过表达 的thp-1巨噬细胞感染或不感染tm 24h后，分别提取细胞质和细胞核蛋白，wb检测 ncor2-013的表达；b为ncor2-013过表达的thp-1巨噬细胞感染或不感染tm 24h后， if检测ncor2-013的定位和表达情况；
25.图4是ncor2-013过表达的thp-1巨噬细胞及其阴性对照株检测，a为ncor2-013 过表达的thp-1巨噬细胞及其阴性对照株感染tm 24h，cfu实验展示其抗tm水平；b 为ncor2-013过表达的thp-1巨噬细胞及其阴性对照株感染或不感染tm 24h后，qpcr 检测细胞因子tnf-α和il-1β的表达情况；
26.图5是ncor2-013-tbl1xr1-tblr1-hdac3-junb复合体的形成，其中，a为筛选 与ncor2-013的结合的转录因子的技术路线；b为用flag抗体做ip，用wb检测smrt、 tbl1xr1\tblr1、hdac3、junb的表达；c为用junb抗体做ip，用wb检测smrt、 tbl1xr1\tblr1、hdac3、flag的表达；d为用tbl1xr1\tblr1抗体做ip，用wb 检测smrt、flag、hdac3、junb的表达；e为用hdac3抗体做ip，用wb检测smrt、 tbl1xr1\tblr1、flag、junb的表达；
27.图6是ncor2-013-tbl1xr1-tblr1-hdac3-junb复合体抑制tnf-α和il-1β的转录 情况检测，其中，a为使用flag、junb、hdac3、tbl1xr1/tblr1抗体做chip-qpcr 检测tnf-α的启动子区域，b为使用flag、junb、hdac3、tbl1xr1/tblr1抗体做 chip-qpcr检测tnf-αil-1β的启动子区域。
具体实施方式
28.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中的 附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是
本 申请一部分实施例，而不是全部的实施例。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件 的特定细节仅仅是为了帮助全面理解本技术的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚， 可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本技术的范围和精神。另外，为了 清楚和简洁，实施例中省略了对已知功能和构造的描述。
29.应该理解，说明书通篇中提到的“一个实施例”或“本实施例”意味着与实施例有关 的特定特征、结构或特性包括在本技术的至少一个实施例中。因此，在整个说明书各处出 现的“一个实施例”或“本实施例”未必一定指相同的实施例。此外，这些特定的特征、 结构或特性可以任意适合的方式结合在一个或多个实施例中。
30.此外，本技术可以在不同例子中重复参考数字和/或字母。这种重复是为了简化和清楚 的目的，其本身并不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。
31.本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系， 例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，单独存在b，同时存在a和b三种情况，本文 中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，a/和b，可以 表示：单独存在a，单独存在a和b两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关 联对象是一种“或”关系。
32.本文中术语“至少一种”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种 关系，例如，a和b的至少一种，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b 这三种情况。
33.还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体 或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在 任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵 盖非排他性的包含。
34.实施例1
35.本实施例通过rna-seq测序筛选tm感染特异性的ncor2可变剪切体，具体的如图 1所示，a为tm感染thp-1巨噬细胞24h后ncor2每个转录本的表达热图；b为qpcr 验证tm感染thp-1巨噬细胞后，ncor2-013的表达情况；c为ncor2-013剪切体的结 构及其蛋白序列。
36.其中，马尔尼菲篮状菌(tm)感染诱导thp-1巨噬细胞ncor2产生可变剪切体 ncor2-013，ncor2-013剪切体的结构及其蛋白序如下：所述ncor2-013剪切体由四个 外显子构成，分别为ense00001612626、ense0000997027、ense0000997044、 ense00001703068(均为5’端到3’端)，其序列依次如seq id no.1、seq id no.2、 seq id no.3、seq id no.4所示；其中蛋白序列如seq id no.5所示。
37.通过筛选实验，结果显示：tm感染可以诱导thp-1巨噬细胞ncor2-013显著上调。
38.实施例2
39.本实施例构建ncor2-013过表达的thp-1巨噬细胞，如图2所示，构建和验证 ncor2-013过表达的thp-1巨噬细胞。a为qpcr验证thp-1巨噬细胞ncor2-013过表 达效率；b为wb验证thp-1巨噬细胞ncor2-013过表达效率。结果显示：ncor2-013 过表达的thp-1巨噬细胞构建成功。
40.具体的：
41.(1)细胞培养
箱培养48-72h，期间注意观察是否存在污染(常见为细菌污染、原虫污染和霉菌污染)， 再确认孢子无污染后进行分装，用封口胶密封后放于4℃保存(一个月内使用)。若需要长 期保种，则需要配置真菌冻存液(50％甘油、50％无菌pbs)，随机选取分装的真菌孢子放 入离心机，14000g离心5min，去掉上清，用真菌冻存液充分重悬真菌孢子，放置负80超 低温冰箱保存。
54.(3)tm-细胞感染模型
55.首先配置dmem完全培养液-真菌孢子混合液，根据所感染的细胞数目计算对应的真 菌孢子数目(感染复数取1：10，即一个细胞对十个孢子)，将真菌孢子加入dmem完全 培养液充分混匀。根据需要取适量的pma刺激完成的thp-1巨噬细胞，弃去细胞培养上 清液，加入含有真菌孢子的dmem完全培养液，放入细胞培养箱培养，根据需要进行后 续实验。
56.(4)提rna、逆转录和qpcr
57.trizol法提取细胞的总rna：移除细胞培养上清液，并用无菌pbs清洗1-2次。使用 trizol专用移液器每孔加入500μl trizol裂解液，缓慢摇晃培养板使trizol充分浸润细胞， 常温静置5min。然后使用trizol专用移液器反复吹打培养板底部的细胞，直至trizol将培 养板中的细胞全部溶解。
58.每个离心管加入100μl氯仿(比例为每1000μl trizol裂解液加200μl氯仿)，盖紧盖 子，上下颠倒混匀15s，室温孵育3min。
59.放入4℃低温离心机中，14000rpm离心15min，取出后可以发现离心管中的液体分为 三层，分别为下层红色的苯酚-氯仿相，中间相和上层水相，其中总rna溶解于上层水相 中。
60.将上层水相小心地转移至新的离心管中(注意不可吸取中间相)，加入250μl异丙醇。 轻微地上下颠倒混匀液体，室温孵育10min。置于4℃低温离心机，14000rpm离心10min， 取出后可在离心管管底部观察到白色凝胶状沉淀，即为rna沉淀。
61.弃上清(用移液枪将离心管中异丙醇清除干净，清除不干净会影响rna的纯度)，加 入500μl 75％乙醇(乙醇应现配现用，用depc处理水和无水乙醇配置)，手动上下颠倒 混匀，置于4℃低温离心机中，14000rpm离心5min。
62.倒掉离心管中的乙醇，并将离心管倒扣在吸水纸上，吸干并晾干管壁上剩余的乙醇(此 步骤约5-10min，但注意乙醇不能完全晾干，否则rna将难以溶解)，加入无酶水20μl， 用移液枪轻轻吹打以溶解rna，放置56℃金属浴孵育10min。
63.rna逆转录成cdna：采用日本塔克拉公司的primerscripttm rtmaster mix-rr036a 逆转录试剂盒将rna样本逆转录成cdna样本。逆转录体系按照下表方案配制(全程需 要在冰上操作)：
64.表1 primerscripttm rt master mix-rr036a逆转录配置体系
65.66.将200μl八联管放置掌上离心机瞬离，然后放入梯度pcr仪按照下表条件进行逆转 录反应：
67.表2 primerscripttm rt master mix-rr036a逆转录条件
[0068][0069][0070]
荧光定量pcr(qpcr)采用takara sybr premix ex taqtm ii-rr820a试剂盒：在0.1ml 透明半裙边96孔pcr板进行qpcr反应，按照下表配置反应体系并均匀地加入指定的孔 中，均匀贴上封板膜，保证孔上没有气泡后置于离心机中，500rpm离心3min，放入abi 荧光定量pcr仪(具体程序见表4)。
[0071]
表3 qpcr反应体系
[0072][0073]
表4 qpcr反应条件设置
[0074][0075]
引物设计和合成：使用primer bank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)数据库 进行引物设计，如下表所示。
[0076]
表5人巨噬细胞引物序列
[0077][0078][0079]
(5)wb检测
[0080]
总蛋白的提取：弃去细胞培养板的培养上清，使用无菌pbs清洗1遍。加入600μledta充分混匀后放入37℃培养箱中孵育5min，取出加入600μl dmem完全培养液，使 用移液器轻轻吹打培养板，尽量将所有细胞清洗下来，并转移至离心管中，4℃14000g离 心5min。同时细胞培养板加入无菌pbs，轻微吹打后转移至离心管中，重复上述离心步骤。 充分弃上清，每管加入120μl ripa蛋白裂解液(蛋白裂解液需提前加入pmsf，按照每 100μl ripa蛋白裂解液加入1μl pmsf配制)，使用移液器反复吹打，直至裂解液由粘稠 状态变为水状，无拉丝现象，将离心管置于冰上裂解30min。随后放入离心机4℃14000g 离心15min，使用移液器将上清转移至新的离心管中，即为提取的细胞总蛋白液。
[0081]
上样与电泳：sds-page聚丙烯酰胺凝胶上第1个边缘孔加蛋白marker(pagerulerprestained protein ladder)3μl，第2、8两个孔分别加适合体积的实验样本，保证蛋白上 样量不少于50μg，上样使用点样枪头，并尽可能缩短上样时间。开始电泳，首先50v电 压电泳1h，待样本跑过分离胶，再把电压调至120v，继续电泳1-1.5h，当样本跑至分离 胶底部时可终止电泳(或者根据目的蛋白的位置自行选择停止电泳的时机)。
[0082]
转膜：剪取适当大小的pvdf膜，浸泡在100％甲醇中活化5min。小心取出sds-page 凝胶，用双蒸水充分润湿浓缩胶及分离胶，根据需要进行切胶。在转膜夹上按照从负极到 正极(转膜夹上从黑色到白色)的顺序依次铺开：海绵-滤纸(2张)-sds-page凝胶-pvdf 膜-滤纸(2张)-海绵，在铺每一层后均使用滚轮轻轻压平，充分赶走气泡。安装转膜装置， 加入转膜缓冲液至完全浸泡，将整个装置放于泡沫盒冰浴，设定恒定电流为250ma，转膜 时间为60min。
[0083]
封闭：转膜完成后，将pvdf膜放置于玻璃盒中，加入pbst缓冲液，水平摇床 (120rpm/min)进行漂洗5min，重复清洗3次，充分洗去pvdf膜上的转膜液。加入适量 脱脂奶粉封闭液(2.5g脱脂奶粉+40mltbst缓冲液)，水平摇床室温孵育1h(80rpm/min)。
[0084]
孵育一抗：使用抗体稀释液选择合适的比例配置一抗。取出pvdf膜，使用pbst充 分洗去pvdf膜上的牛奶，放入一抗稀释液中，4℃摇床孵育过夜。
[0085]
孵育二抗：二抗用抗体稀释液稀释，按照1:15000的比例分别配制抗鼠和抗兔的二抗。 使用pbst充分洗去pvdf膜上未结合的一抗。将pvdf膜放入配制好的二抗稀释液中， 水平摇床室温避光孵育1h。
[0086]
上机检测：使用pbst充分洗去pvdf膜上未结合的二抗。使用odyssey clx双色红 外激光成像系统扫膜并进行定量分析。目的蛋白相对表达量目的蛋白条带灰度值/内参(β
ꢀ‑
actin)灰度值。
[0087]
实施例3
[0088]
基于上述实施例，验证ncor2-013的细胞定位。
[0089]
如图3所示，ncor2-013剪切体在thp-1巨噬细胞的定位，a为ncor2-013过表达 的thp-1巨噬细胞感染或不感染tm 24h后，分别提取细胞质和细胞核蛋白，wb检测 ncor2-013的表达；b为ncor2-013过表达的thp-1巨噬细胞感染或不感染tm 24h后， if检测ncor2-013的定位和表达情况。
[0090]
结果显示：ncor2-013主要定位于细胞核。
[0091]
实施例4
[0092]
计数真菌菌落形成单位(cfu)的数量：配置酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(ypd) 用于菌落计数。称取9.8gypd培养基颗粒，放入盛有200ml双蒸水的锥形瓶中，放入高压 灭菌锅，121℃高压灭菌20min，待温度降到50℃时，取出锥形瓶于安全柜倒平板。
[0093]
将thp-1巨噬细胞与马尔尼菲篮状菌孢子在37℃和5％co2的条件下孵育24小时 (moi＝10)。收集细胞上清培养液，并用无菌水充分裂解细胞，以释放马尔尼菲篮状菌， 并转移至收集的细胞上清培养液中。混合液进行四次梯度系列稀释(0倍、10倍、100倍 和1000倍)，并将其接种在ypd培养基上。放入37℃生化培养箱孵育24小时，计数真 菌菌落形成单位(cfu)的数量。
[0094]
如图4所示，a为ncor2-013过表达的thp-1巨噬细胞及其阴性对照株感染tm 24h， cfu实验展示其抗tm水平；b.ncor2-013过表达的thp-1巨噬细胞及其阴性对照株感 染或不感染tm 24h后，qpcr检测细胞因子tnf-α和il-1β的表达情况。
[0095]
结果显示：过表达ncor2-013可以显著抑制促炎因子tnf-α和il-1β的上调，促进 tm的增殖。
[0096]
实施例5
[0097]
本实施例介绍的是ncor2-013-tbl1xr1-tblr1-hdac3-junb复合体的形成，具体 的，如图5所示，a为筛选与ncor2-013的结合的转录因子的技术路线；b为用flag 抗体做ip，用wb检测smrt、tbl1xr1\tblr1、hdac3、junb的表达；c为用junb 抗体做ip，用wb检测smrt、tbl1xr1\tblr1、hdac3、flag的表达；d为用 tbl1xr1\tblr1抗体做ip，用wb检测smrt、flag、hdac3、junb的表达；e.为用 hdac3抗体做ip，用wb检测smrt、tbl1xr1\tblr1、flag、junb的表达。
[0098]
经过实验，结果显示：ncor2-013与tbl1xr1-tblr1-hdac3-junb形成复合物。
[0099]
其中chip-qpcr检测：使用碧云天chipassay kit(p2078)检测。
[0100]
实施例6
[0101]
关于抑制tnf-α和il-1β的转录：
[0102]
如图6所示，ncor2-013-tbl1xr1-tblr1-hdac3-junb复合体抑制tnf-α和il-1 β的转录测试。a为使用flag、junb、hdac3、tbl1xr1/tblr1抗体做chip-qpcr检 测tnf-α的启动子区域，b为使用flag、junb、hdac3、tbl1xr1/tblr1抗体做 chip-qpcr检测tnf-αil-1β的启动子区域。
[0103]
结果显示：ncor2-013、tbl1xr1/tblr1、hdac3和junb就能与tnf-α和il-1 β的启动子区域结合，ncor2-013形成的复合体可以直接调控tnf-α和il-1β的转录。
[0104]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本 领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通 过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实 施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。